南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质含量

南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质含量3杨逢建　庞海河　张学科　孙佳音　祖元刚33(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040)摘　要　通过高效液相色谱(HP LC ),测定了人工栽培南方红豆杉枝叶中药用抗癌活性物质紫杉醇(taxol )、三尖杉宁碱(cephal omannine )和人工半合成紫杉醇的主要原料巴卡亭Ⅲ(bac 2catin Ⅲ)、102去乙酰基巴卡亭Ⅲ(102deacetylbaccatin Ⅲ,102DAB )在一个生长季的含量变化.研究表明:从4月新枝叶萌发至11月枝叶基本停止生长,南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质含量季节性变化明显.其中紫杉醇和三尖杉宁碱含量的最高值都出现在5月;巴卡亭Ⅲ和102去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量的最高峰值分别出现在9月和4月.相关分析发现,南方红豆杉枝叶中4种药用活性物质之间有很好的相关性,其中紫杉醇与三尖杉宁碱含量呈显著正相关(P <0105),三尖杉宁碱含量与102去乙酰巴卡亭Ⅲ含量呈显著负相关(P <0105).关键词　南方红豆杉　抗癌活性物质　含量文章编号　1001-9332(2008)04-0911-04　中图分类号　Q946188　文献标识码　AQuan tit a ti ve changes of an ti 2cancer acti ve co m ponen ts i n Taxus ch inensis var .m a irei bran 2ches and leaves .Y ANG Feng 2jian,P ANG Hai 2he,ZHANG Xue 2ke,S UN J ia 2yin,Z U Yuan 2gang (Key L aboratory of Forest P lant Ecology of Education M inistry,N ortheast Forestry U niversity,Har 2bin 150040,China ).2Chin .J.A ppl .Ecol .,2008,19(4):911-914.Abstract:The quantitative changes of anti 2cancer ingredients such as taxol,cephal omannine,bac 2catin Ⅲand 102deacetylbaccatin Ⅲin the branches and leaves of Taxus chinensis var .m airei dur 2ing one gr o wth seas on were measured by HP LC .The results showed that the contents of these anti 2cancer ingredients had an obvi ous change fr om Ap ril when the ne w branches began t o ger m inate t o Nove mber when the branches basically st opped gr owing .The contents of taxol and cephal omannine in the branches and leaves of T .chinensis had the sa me change pattern,with the peaks appeared in May,and those of Baccatin Ⅲand 102deacetylbaccatin Ⅲhad the sa me change trend,with the highest values appeared in Sep te mber and Ap ril,res pectively .There was a significant positive cor 2relati on bet w een the contents of taxol and cephal omannine (P <0105),and a negative correlati on bet w een the contents of cephal omannine and 102deacetylbaccatin Ⅲ(P <0105).Key words:Taxus chinensis var .m a irei ;anti 2cancer active component;content .3国家“十一五”科技支撑计划资助项目(2006BAD18B0303).33通讯作者.E 2mail:zygorl@vi p.hl .cn 2007208223收稿,2008201224接受. 自从971年美国化学家W ani 等[1]首次在叶红豆杉(Taxus brevifolia )中分离出具有独特结构的二萜类成分———紫杉醇(taxol )以来,紫杉醇以其独特的抗癌活性引发红豆杉属植物的研究热潮.紫杉醇等抗肿瘤药物除成功地应用于治疗卵巢癌和乳腺癌外,还用于肺癌、卡波氏肉瘤和肝癌的治疗,对其它多种恶性肿瘤的疗效也在试验中[2].随着对该类药物需求量的日益增加,其来源已逐渐成为制约整个产业发展的瓶颈[2-3].研究表明,紫杉醇不仅存在于短叶红豆杉的树皮中,也存在于其针叶、根和树枝中[4],而且其它种类的红豆杉也含有紫杉醇[5-7].然而,红豆杉属植物的一个共同特征是生长缓慢、自身繁殖率低、紫杉醇含量很低,远远不能满足临床需要.同时,野生红豆杉是国家一级保护植物,严格禁止非法砍伐,因此,严重地制约着紫杉醇的工业化生产.为了解决紫杉醇工业化生产的原料来源问题,很多学者进行了多方面的研究[8-12],认为解决途径主要有5种:1)选育并大量栽种生长快、紫杉醇或前体含量高的红豆杉植物.这是除了从天然红豆杉树皮中提取紫杉醇以外获得紫杉醇的一个主要途径.2)化学合成紫杉醇.紫杉醇结构复杂,化学合成难度很大,目前全合成工作虽已完成,但由于合成路线比较复杂,尚无商业应用的价值.3)真菌发酵.从红应用生态学报　2008年4月　第19卷　第4期 Chinese Journal of App lied Ecol ogy,Ap r .2008,19(4):911-914豆杉的树皮中分离到了一些能产生紫杉醇的真菌,但其合成紫杉醇的能力极低,尚无发酵生产的价值.4)紫杉醇的半合成.从Taxus baccata的针叶中得到巴卡亭Ⅲ(baccatinⅢ)和102去乙酰基巴卡亭Ⅲ(102deacetylbaccatinⅢ)作为原料半合成紫杉醇,而且不会威胁树木的生长.这是目前一种比较有潜力的替代途径.5)利用植物组织和细胞培养生产紫杉醇.根据细胞全能性的观点,通过细胞培养方式大量生产其亲本具有的天然产物.但因细胞生长缓慢、紫杉醇产量低,始终是其工业化生产的制约因素.综上所述,人工栽培红豆杉是解决工业化生产紫杉醇等活性物质资源缺乏问题的一种可行方法[13].南方红豆杉(Taxus ch inensis var.m airei)又称美丽红豆杉,特产于我国,是红豆杉科红豆杉属中分布最广、生长最快的植物[14].研究发现,人工栽培的南方红豆杉化学成分与野生的南方红豆杉中化学成分相近[15],而且人工栽培的南方红豆杉中紫杉醇含量与野生的南方红豆杉中紫杉醇的含量相当[16-17].目前,我国人工栽培南方红豆杉在浙江、江西、四川和湖南等地已经形成较大的规模,并开始用于紫杉醇生产.迄今为止,关于人工栽培南方红豆杉的研究主要集中于繁育和栽培技术方面[18-20],对人工栽培南方红豆杉中紫杉醇等活性物质含量的季节动态研究尚未见报道.开展南方红豆杉枝叶中紫杉醇等活性物质含量的系统分析,对红豆杉资源的综合开发利用具有重要价值.为此,本文以人工栽培5年生的南方红豆杉枝叶为材料,通过高压液相色谱(HP LC)检测其枝叶中药用抗癌成分紫杉醇、三尖杉宁碱(cephal omannine)和人工半合成紫杉醇的主要原料巴卡亭Ⅲ、102去乙酰基巴卡亭Ⅲ活性物质含量的季节动态及其相互关系,以期为人工栽培南方红豆杉资源的综合开发利用提供科学依据.1　研究地区与研究方法111　研究地概况研究地位于浙江省富阳市胥口镇下练村杭州海正药用植物有限公司种植基地(29°44′—30°11′N, 119°25′—120°09′E).研究地属中亚热带季风气候,年均气温约16℃,无霜期220～240d,全年平均降水量为193816mm,降水集中在4—9月,占全年降水量的68%.112　研究方法11211供试材料　1)南方红豆杉枝、叶:在2006年4—11月的一个生长季节内,每月分别采集南方红豆杉枝、叶样品,每个样品采自5～7个植株,对植株上、中、下部位的新、老枝叶进行均匀取样,分别测定3个不同位置样品紫杉醇的含量,取平均值.2)仪器设备和药品:主要仪器包括P230高效液相色谱仪(大连依利特),色谱柱C18柱(200mm ×416mm,5μm),Sart orius分析天平,S Q2119C匀浆机(西贝乐),T DL8022B离心机,K Q2250DB超声机和旋转蒸发仪(上海申胜).药品包括紫杉醇、三尖杉宁碱、102去乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ标准品(Sig ma)、乙腈为色谱纯,甲醇和乙醇为分析纯. 11212紫杉醇等药用活性物质的提取检测方法[21]　1)提取方法:取南方红豆杉样品10g,与100m l 80%的乙醇溶液混合置于匀浆机内匀浆3m in,离心力为1776×g,离心4m in,保留上清液,沉渣再加入80%的乙醇溶液30m l,放入超声机内超声提取30m in,离心保留上清液,沉渣再进行超声提取2次,每次使用80%的乙醇溶液30m l提取30m in,保留2次提取的上清液.将4次提取的上清液合并,浓缩至干,加入2m l甲醇溶解,离心取样,用0145μm 的微孔滤膜滤过,待测,每个样品重复3次.2)检测方法:色谱柱为Hypersil C18ODS25μm (250mm×416mm);流动相为乙腈ν水(V∶V= 42∶58),流速110m l・m in-1,进样量10μl,波长为227n m,柱温25℃.4种化合物的平均回收率在97112%～99108%,RS D在1147%～1181%(n= 6),且稳定性和重复性良好.113　数据分析采用SPSS软件中的Peas on进行双变量相关性分析,并进行单尾检验,判断其相关显著性.用Excel 作图.2　结果与分析211　南方红豆杉枝叶中药用活性物质的含量由图1可以看出,从4月新枝叶萌发至11月枝叶基本停止生长,南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质含量的季节变化规律明显,在5月、8月和10月分别出现3个比较明显的高峰,且峰值依次降低,分别为01515、01264和01217mg・g-1;三尖杉宁碱含量的季节变化规律与紫杉醇的变化趋势相一致,但仅在5月和10月出现2个比较明显的高峰,分别为01020和01016mg・g-1;102去乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ的季节变化规律基本一致,均在4月和9月出现整个生长季节内的最高值,前者的峰219 应　用　生　态　学　报 19卷图1　南方红豆杉枝叶中不同药用活性物质的含量F i g.1　Content of taxanes in branches and leaves of T.chinen2 sis var.m airei.A:102去乙酰基巴卡亭Ⅲ102deacetylbaccatinⅢ;B:紫杉醇Taxol; C:巴卡亭ⅢbaccatinⅢ;D:三尖杉宁碱Cephal omannine.值分别为01367和01179mg・g-1,后者分别为01022和01041mg・g-1.212　南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质间的相关性由表1可以看出,南方红豆杉枝叶中紫杉醇与三尖杉宁碱含量呈显著正相关(P<0105),相关系数为01692;而与巴卡亭Ⅲ和102去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量呈负相关,但并不显著(P>0105);南方红豆杉枝叶中三尖杉宁碱含量与巴卡亭Ⅲ含量呈正相关,但并不显著(P>0105),与102去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量呈显著负相关(P<0105);南方红豆杉枝叶中巴卡亭Ⅲ含量与102去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量呈正相关,但不显著(P>0105).表1　南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质的Pearson 相关系数矩阵Tab.1　Pearson correl a ti on ma tr i x of the t axanes i n bran2 ches and leaves of T.ch inensis var.m a ireiA B C SA11000B01692311000C-011990144311000D-01362-0167830154211000A:紫杉醇Taxol;B:三尖杉宁碱Cephal omannine;C:巴卡亭ⅢBac2 catinⅢ;D:102去乙酰基巴卡亭Ⅲ102deacetylbaccatinⅢ.3P< 0105.3　讨 论目前,国内外已建立了很多红豆杉栽培基地,以及102去乙酰基巴卡亭Ⅲ和巴卡亭Ⅲ再转化成紫杉醇的高效人工半合成体系,而且应用前景广阔[22-24].此外,三尖杉宁碱对鼻咽癌等也具有显著的抑制作用.本研究结果表明,从4月新枝叶萌发至11月枝叶基本停止生长,南方红豆杉枝叶中紫杉醇等药用活性物质含量的季节变化明显,这与王昌伟等[25]的研究报道相一致.在研究地,南方红豆杉4月休眠芽开始萌发,到5月,随着光照的增强和时间延长,可能刺激或者激活了一些紫杉醇生物合成酶(如苯丙氨酸转氨酶[26])来合成新的紫杉醇,使紫杉醇含量达到一个峰值.然而大量的紫杉醇累积在细胞中会抑制红豆杉自身细胞微管的解聚,紫杉醇含量的增加打破了其自身的平衡,必然会引起红豆杉机体作出应激反应,将紫杉醇以结合态糖基化的形式贮存于植物体内,造成了植物体内游离态的紫杉醇含量减少,周而复始,呈现周期性变化.相关分析发现,南方红豆杉枝叶中4种药用活性物质之间有很好的相关性,其中南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量与三尖杉宁碱含量呈显著正相关,是因为紫杉醇与三尖杉宁碱结构类似,有相同的合成前体,相似的生物合成途径[26];而三尖杉宁碱含量与102去乙酰基巴卡亭Ⅲ含量呈显著负相关(P<0105).研究表明,温度、光照和水分是影响人工栽培的南方红豆杉生长及其次生代谢的主要环境因素,光胁迫能提高南方红豆杉中紫杉醇的含量[27].所以,应将102去乙酰基巴卡亭Ⅲ、巴卡亭Ⅲ、三尖杉宁碱等药用成分的含量也纳入到人工栽培的南方红豆杉资源的评价指标中,从而提高其资源的利用率,促进资源的综合开发利用.此外,在南方红豆杉人工种植过程中,应用一定的生态调控措施,或在原料采收后,采用一定的生物转化措施来提高南方红豆杉中紫杉醇及其衍生物的含量及其资源利用率,是今后需深入研究的内容之一.参考文献[1]　W aniMC,Tayl or HL,W allM E,et al.Plant antitu moragentⅥ:The is olati on and structure of taxol,a novelantileuke m ic and antitu mor agent fr om Taxus brevifolia.Journal of the Am erican Che m ical Society,1971,93:2325-2327[2]　Fl 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