DNA提取及常见问题分析
DNA提取及常见问题分析解析
第二部分：DNA提取方法简介
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
CTAB法 SDS法
其它
线粒体、叶绿体DNA的提取
差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
SDS 是一种阴离子去垢剂，在高温（ 55 ～ 65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的 DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份 Tris-HCl EDTA NaC （pH8.0） （pH8.0）l 100 mM 20 mM CTAB PVP40 β-巯基乙 醇 2%（V/V） 使用前加 入
SDS法DNA提取缓冲液
组份 Tris-HCl EDTA （pH8.0） （pH 8.0 ）NaCl SDS
终浓 度
10 mM
20 mM
0.4M
2%
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提 离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
DNA提取中的常见问题分析
提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰， DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？参考见解：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。
而CTAB法提取可基本上除去多糖。
如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：1、在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。
如可用缓冲液：100 mmol/LTris -HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。
2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。
在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。
3、沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。
如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。
或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。
4、多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。
如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀物，将清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下 DNA 部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。
还有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。
上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。
然而这些方法均会在一定程度上减低DNA 的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有特异性吸附的树脂来纯化 DNA。
曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G ，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。
血样4度保存了2月，现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA，有什么解决办法？参考见解：按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来，下面是参考方法：1、首先洗出白细胞，最好有1毫升以上血液。
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。
2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。
3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。
不同来源样品的加样量不同。
4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。
洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。
同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。
洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。
二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。
2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
高产高效DNA提取手段常见问题原因诊断策略定位法
高产高效DNA提取手段常见问题原因诊断策略定位法DNA提取是分子生物学研究中常用的重要实验步骤，其目的是从细胞或组织样本中提取出高质量的DNA。
然而，在DNA提取的过程中，常常会遇到一些问题导致低产或低效的情况。
本文将针对高产高效DNA提取手段常见问题进行原因诊断和策略定位，帮助科研人员解决相关的实验难题。
1. 低DNA产量的问题：低DNA产量可能是由以下几个方面的原因导致的：1.1 样本因素：- 细胞或组织样本中DNA含量本身较低；- 样本存储不当，导致DNA降解；- 样本含有DNA酶或其他污染物。
1.2 提取步骤因素：- 细胞或组织裂解效果不理想；- DNA粘附在某些物质上无法充分溶解；- 溶解缓冲液中的离子浓度或pH值不适宜；- DNA提取试剂的质量不过关。
针对低DNA产量的原因，可以采取以下策略定位和改进措施：- 重新评估样本的储存条件和处理方式，确保样本质量良好；- 优化细胞或组织的裂解过程，可尝试使用化学物质、酶或高温等方法增强裂解效果；- 使用高纯度的蛋白酶K等去除DNA酶或其他污染物；- 确保溶解缓冲液具有合适的离子浓度和pH值，可根据实际情况进行调整；- 选择质量可靠的DNA提取试剂盒，确保试剂的活性和纯度。
2. 低DNA提取效率的问题：低DNA提取效率可能是由以下几个方面的原因导致的：2.1 样本因素：- 样本中DNA含量较低；- 样本中存在DNA降解酶。
2.2 提取步骤因素：- DNA在某些步骤中流失或粘附在器具壁上；- 某些试剂的浓度不适宜。
为了提高DNA提取效率，可以采取以下策略定位和改进措施：- 使用高质量的样本，确保样本中已有DNA的充足量；- 添加DNase酶抑制剂或其他方法抑制DNA降解酶的活性；- 定期更换或清洗使用的器具，防止DNA的流失或粘附；- 审查并校正提取试剂的浓度，确保试剂与样本反应的适宜性。
3. 其他常见问题与策略定位：除了低产量和低效率的问题外，还有其他常见的DNA提取相关实验问题，例如：3.1 DNA质量下降：- 样本的存储时间过长，导致DNA降解；- 提取试剂的质量不过关。
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析
分子实验中核算DNA提取常见问题及分析一、基因组DNA提取常见问题分析1．样品材料老化或反复冻融导致DNA含量下降：应选择新鲜的材料样品，如新鲜血液、新鲜菌液、刚离体的动物组织或细嫩的植物组织等，不能即时处理的样品应立即放入液氮或-70C低温保存，以免DNA 降解。
2．样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放：动、植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G +细菌、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械方式协助破壁。
3．样品量过多导致细胞裂解不充分：加样量过多使裂解液和样品混合不均匀，细胞裂解不充分。
不同来源样品的加样量不同。
4．DNA吸附不充分：如在上吸附柱前未加无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA 不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此应在样品裂解后加适量无水乙醇，再上吸附柱使DNA与硅胶膜充分吸附。
5．DNA洗脱不适当：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶膜上洗脱下来，应确保洗脱液pH 值在7.0-8.5之间。
洗脱体积过少，若小于30ul,不易完全浸透硅胶膜，使DNA不能全部洗脱下来，因此洗脱缓冲液应大于30ul。
同时如洗脱体积过大，超过200ul,则所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。
洗脱时可将洗脱缓冲液在65-70℃水浴预热，加入洗脱液后在室温静置2-5分钟，可提高洗脱效率,加大DNA产量。
二、提取的基因组DNA有降解，如何解决?1．选取的材料不新鲜或反复冻融，采集材料后未及时处理或未低温保存：陈旧血液，老化菌液等不新鲜的材料中，细胞凋亡导致DNA降解，或低温保存的样品反复冻融导致细胞破裂，内源核酸酶降解DNA，因此应选择新鲜的材料样品，不能及时处理则低温保存，运输过程中亦应使用干冰。
2．未能有效抑制内源核酸酶作用：某些DNase含量较丰富的动、植物组织样品应在液氮中研磨或匀浆，研磨过程中应随时补充液氮，并在样品未完全解冻前即加入含有抑制核酸酶作用的鳌合剂的裂解液。
质粒DNA提取实验常见问题解答
质粒DNA提取实验常见问题解答1.加入solution.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，有的漂浮在液面，有的贴在离心管壁上，一摇晃即破碎脱落下来？细菌的用量太少，导致产生的沉淀主要是盐分的沉淀，因为缺少变性的细菌蛋白和细菌基因组DNA 的缠绕，沉淀就显得不结实。
解决方法：将细菌的用量增加。
2.加入soln.III，经10分钟离心后细菌沉淀怎么不结实，呈大块的水泡状，上清较少？（1）使用了过多的细菌，导致菌体未被有效裂解。
解决方法：将细菌用量减半。
（2）细菌悬浮不充分,存留小菌块,导致菌体未被有效裂解。
解决方法：注意将细菌悬浮充分。
（3）加Solution III后中和不充分。
解决方法：如果细菌用量较多，请注意多翻转几次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花状(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花状)。
（4）Solution II出现沉淀。
解决方法：如果实验室内温度低于15℃，使用试剂盒前请注意观察Solution II中是否出现沉淀。
如果出现沉淀，请于37℃水浴溶解沉淀后再使用。
（5）Solution II 长时间暴露于空气中被CO2中和，导致菌体未能被有效裂解。
解决方法：可用经典碱裂解法抽提质粒DNA方法中的II液替代Solution II使用。
3.出现严重的RNA污染？（1）未在Solution I中事先加入RNase A1。
解决方法：补加RNase A1。
（2）加入RNase A1的Solution I长期保存于室温，导致RNase A1活性下降。
（3）细菌过量,RNase A1不能有效降解RNA。
解决方法：将细菌用量减半或增加RNase A1在Solution I中的浓度。
4.抽提的质粒DNA电泳时怎么出现切口.断裂或降解现象？（1）使用的是收集后冷冻保藏的细菌。
解决方法：使用新鲜培养的细菌。
（2）宿主菌富含核酸内切酶。
解决方法：增加一步Rinse A洗涤步骤以彻底去除残留的核酸内切酶。
《DNA的粗提取和鉴定》实验中的几个常见问题
《DNA的粗提取和鉴定》实验中的两个常见问题陶晓东（江苏省常州市武进高级中学生物组213161）摘要：中学实验中提取DNA的实验材料的选择问题，几种实验材料各自的优缺点；DNA鉴定过程中易出现的一些常见问题及具体的解决方案。
关键词：鸡血细胞DNA提取液二苯胺试剂人教版高中生物教材第二册（必修）中的实验十一《DNA的粗提取和鉴定》是一个比较重要的学生实验。
该实验比较复杂，在实际操作过程中需要注意的细节问题也非常多，而且往往因为某个环节的操作不当，结果不能观察到明显的实验现象。
因此，有必要对实验过程中应当注意的问题做一些探讨。
从我个人和学生的实际实验操作过程中，我认为有以下两个问题值得注意。
一、实验材料的选择问题：虽然各种生物细胞中都含有大量的DNA，但是并不是每一种生物组织都适合做提取DNA的原材料。
比较好的实验材料最好应该满足以下几个条件1．组织中DNA的含量比较丰富,能够适合大量提取。
2．该组织中所含化合物种类应比较单纯,避免由于其他物质化学性质与DNA相近，从而对实验现象产生某些干扰。
3．实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。
4．实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单的条件下能大量提取出DNA，便于学生实验操作。
可用于提取DNA的实验材料很多，人教版高中生物第二册教师教学用书中提供了两类可用于提取DNA的实验材料：鸡血和植物组织（新鲜菜花、蒜黄、菠菜等）；另外在《实验教学与仪器》杂志2002年第一期的《探讨“DNA 的粗提取与鉴定”的实验改进》一文中提供了另一种可行的实验材料：鱼类的精巢；此外，在高教出版社《生化实验方法和技术》一书中还介绍了一种从动物胸腺中提取DNA的方法，这是一种大学教材上提供的方法。
这几种实验材料由于各自性质的差异，实验的操作过程和步骤有很大的差别，以下是四种实验材料特点的粗略比较。
注：SDS ：十二烷基磺酸钠EDTA ：乙二胺四乙酸二钠根据以上对比可以看出,如果从取材方面来考虑的话,以动物胸腺组织作为实验材料是不经济的,而且还要面临中学实验条件的限制等问题。
基因组提取常见问题解析
基因组提取常见问题解析一、引言基因组提取是生物实验中的一项基本技术，主要用于获取生物体的DNA或RNA。
在基因组提取过程中，可能会遇到各种问题，这些问题可能会影响提取的效率和纯度，进而影响后续的实验结果。
本文将对基因组提取过程中的常见问题进行解析，旨在帮助实验人员更好地进行实验操作。
二、基因组提取过程中的常见问题1.样本制备问题样本制备是基因组提取的第一步，也是最关键的一步。
在这一步中，实验人员需要将生物样本进行处理，以便后续的提取过程。
然而，样本制备过程中可能会出现一些问题，例如样本量不足、样本被污染、样本中的DNA已经被降解等。
这些问题都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。
2.DNA提取方法DNA提取方法的选择和使用也是影响基因组提取质量的重要因素。
不同的生物样本需要不同的提取方法，如果选择不当或者使用不当，都可能导致提取失败或者提取的基因组质量不高。
此外，不同的提取方法也有其各自的局限性，例如耗时、耗力、提取的DNA量少等。
3.基因组损失和降解基因组损失和降解是基因组提取过程中最常见的问题之一。
在提取过程中，由于各种原因（如机械力、化学反应、酶活性等），DNA可能会被损失或者降解，这会导致提取的基因组不完整或者质量不高。
此外，DNA损失和降解还可能影响后续的实验结果，例如PCR 扩增、测序等。
4.杂质和污染物在基因组提取过程中，杂质和污染物是不可避免的。
这些杂质和污染物可能来源于生物样本本身、提取溶液、实验室环境等。
这些杂质和污染物可能会影响提取的基因组的质量和纯度，进而影响后续的实验结果。
因此，实验人员需要采取有效的措施去除这些杂质和污染物。
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质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
溶液I充分重悬
抽提
溶液II裂解
酒精沉淀
溶液III中和
离心洗涤
沉淀
干燥溶解
质粒DNA溶液
质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 ➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高 pH值洗脱。
快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低
pH值洗脱。
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。
➢ 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
DNA提取的基本步骤
I.材料准备 II.破碎细胞或包膜－内容物释放
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提离心洗涤DNA液细胞裂解上层溶液
干燥溶解
基因组DNA－SDS法
SDS法原理
• 磁珠
适用于纯度要求高的实验。 磁性微粒挂上不同基团可吸附
不同的目的物，从而达到分离
目的。
基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离 各种内容物
DNA提取的几种方法
非染色体DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取 • 碱裂解法 • 煮沸法
➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
基因组DNA－ CTAB法
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
DNA提取及常见问题分析
内容
第一部分：DNA提取方法简介
第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策
前言
DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要 、最基本的操作 。
DNA提取的几种方法
染色体DNA的提取
➢ CTAB法 ➢ SDS法 ➢ 其它
质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/V)
0.1%（V/V） 使用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏
；
➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；
III.核酸分离、纯化 IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质 V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
材料准备
基因组DNA的提取
质粒DNA的提取
➢ 最好使用新鲜材料，低温保 存的样品材料不要反复冻融
➢ 使用处于对数期的新鲜菌体（老化 菌体导致开环质粒增加）
➢ 提取血液基因组DNA时，要 选择有核细胞（白细胞）
➢ 培养时应加入筛选压力，否则菌体 易污染，质粒易丢失
组份
Tris-HCl
EDTA
（pH8.0） （pH 8.0 ）
终浓度 10 mM
20 mM
NaCl 0.4M
SDS 2%
基因组DNA－SDS法
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
基因组DNA－其它方法
根据细胞裂解方式的不同有：
➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相
中；
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
PVP40 β-巯基乙醇
终浓度 100 mM
20 mM
1.4M
3%(W/V)
5%(W/V)
2%（V/V） 使用前加入
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
基因组DNA－ CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方