分子诊断及其临床应用

阴性判 断值
0-1.0
IU/L
0-10.0
COI
0-1.0
COI
>1.01
COI
>1.0
3.00E+04
2.50E+04
2.00E+04
1.50E+04
1.00E+04
5.00E+03
0.00E+00 2010.11.27
2011.2.1
2011.6.15 2011.10.23 2012.1.7
IU/ml copies/ml
在病原微生物方面的应用
• 快速鉴定
实时荧光PCR方法
淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、结核杆菌、
高危型HPV病毒、HSV病毒等
• 定量分析
实时荧光PCR方法
HBV、HCV、HIV、BK、 EB 、 HCMV等
• 病毒分型
PCR-测序法
HBV病毒分型、HCV病毒分型
• 耐药分析
HBV病毒四种耐药分析
PCR-测序法
标准样品的种类： • •含有和待测样品相同扩增片段的克隆质
粒 • •含有和待测样品相同扩增片段的cDNA • •PCR的产物
RQ-PCR中的绝对定量：确定样本中靶DNA的绝对含量
初始DNA量越多, 荧光达 到某一值（域值）时所需要 的循环数越少
在扩增检测待测样本的同 时，扩增一系列已知标准 （通常为质粒DNA），根据 扩增曲线的Ct值与该扩增反 应模板的起始拷贝数的对数 存在线性关系，则可推导出 同时扩增的待测样本中初始 模板量。
• 因此，如果建立一个使用外标准的PCR定量方法， 则必须进行方法的精密度（批内变异）和重复性 （批间变异）分析，以确定其应用的局限性。
定量测定的结果报告
定量测定测定的是量的“多”或“少”；定性测 定则是测定某种物质的“有”或“无”，用于未 知病人的确认诊断。
定量测定结果报告：根据所使用的测定方法的测 定范围报告结果，如样本测定结果高出此范围， 则可报告>多少，也可对样本稀释后再检测；如 低于此范围，则报告<多少，如<103拷贝数/ml， 而不能报告为0拷贝数/ml或阴性。
说明抗病毒治疗效果显著。医生建议其继续服用 拉米夫定，半年后继续复查HBV DNA 载量。 2011年5月，听取医生建议继续复查HBV DNA 载量。 检测结果为5.8 E+03CP/ml，说明HBV 继续活跃复 制，可能由于基因耐药所致。。。。。
• 持续的人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV) 感染是引起宫颈癌和 癌前病变的必要因素，93.0%-99.7%的宫颈癌组织中均可检测到HPV DNA。
每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系。起始拷贝数越多， CT值 越小；模板DNA的起始拷贝数越少，CT值越 大。
实时荧光定量PCR的方法
• 定量PCR方法可分为外标法和内标法 • 定量类型可分为绝对定量和相对定量
绝对定量通过外标准品定量
• 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。
PCR-SSCP（单链构象多态性） PCR-RFLP（限制性片段多态性） PCR-DGGE（变性梯度凝胶电泳）
……
科研为主
PCR 技术
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链式反应 基因体外扩增技术
链式反应－－分子爆炸
1 循环= 2 扩增子
2 循环 = 4 扩增子
3 循环 = 8 扩增子
使用外标的定量PCR方法的优缺点
• 优点：（1）方法简便，容易建立；（2）使用双孔 重复测定，这种方法可得到非常准确的结果，甚至 可排除管间的差异，但不能排除样本间的差异；
• 缺点：PCR反应体系中小的区别也会对测定造成较 大的影响。由于最后在扩增效率上的差异，从而使 得定量测定精密度和重复性不佳。
ห้องสมุดไป่ตู้
常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终产物进行半定量 及定性分析
普通PCR
荧光定量PCR
定量PCR技术： 对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析
实时荧光（定量）PCR荧光示踪方法
• 荧光染料法：SYBR Green 1 ，EB
• 荧光探针法：基于FRET(荧光共振能量转移) 技术 Taqman(水解探针) Hybridization probe(杂交探针) Molecular Beacon(分子信标)
结核杆菌耐药基因突变分析
探针杂交技术
血清分离
DNA提取 人工上样 RT-PCR
检测报告
RT-PCR进行HBV DNA载量分析的实验流程
患者1, 男，22岁，慢性乙肝患者，于2010年11月起定期在我院进行HBV血清学及DNA含量检测， 相关实验室数据如下:
乙肝两对半结果：
项目
2010．11.27
外标法：使用外部标准曲线的方法（绝对定 量）
在扩增检测待测样本的同时，扩增一系列已知标 准（通常为质粒DNA），根据扩增曲线的Ct值与 该扩增反应模板的起始拷贝数的对数存在线性关 系，则可推导出同时扩增的待测样本中初始模板 量。
定量PCR的数学原理
斜率与扩增效率
使用外标定量的要求
以外标准进行定量，必须在扩增的指数期进行； Threshold 尽量处在刚刚进入指数扩增期阶段 扩增指数期取决于PCR模板的相对量
2011.6.15
>3000.00 阳性
<2.00 阴性
0.57 阴性
0.87 阳性
0.60 阳性
2011.10.23
>3000.00 阳性
<2.00 阴性
2.69 阳性
1.62 阴性
0.49 阳性
2012.1.7
>3000.00 阳性
<2.00 阴性
0.92 阴性
0.71 阳性
0.50 阳性
单位 COI
分子信标探针
在变性后退火复性过程中， 分子信标与靶DNA结合，茎环结 构打开成链状，荧光基团与淬灭 基团分开，产生荧光。
EGFR、 K-ras等突变
艾德公司特异引物双环探针技术
QIAGEN公司DxS 蝎子探针技术
优点：突变含量低至1%亦可检出。 EGFR突变检测、K-ras突变检测……
molecular beacon探针：特异性好，背景信号低，扩增效率高，不能做 溶解曲线分析，适合定性、定量及基因突变分析。
• 高危型HPV的持续感染可使患宫颈癌的风险增加250倍。
主要用于基因表达检测，疗效观察等
例：CML病人的BCR-ABL融合基因检测 使用管家基因G6PDH或ABL
相对定量结果的报告
例1：
目的基因A copies/ml
管家基因B copies/ml
A/B
%
或 治疗前A基因 copies/ml 治疗后A基因 copies/ml 治疗后/治疗前 %
一、分子诊断在感染性疾病中的应用
相对定量通过内标定量
• 内标（Endogenous Control）通常是βactin、GAPDH基因等看家基因
• 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝 数恒定，受环境因素影响小
• 内标定量结果代表了样本中所含细胞或 基因组数量
RQ-PCR中的相对定量
即测定同一样本中两种不同基因量的 比率或不同样本中同一基因量的比值
4 循环 = 16 扩增子
5 循环 = 32 扩增子
6 循环 = 64 扩增子
7 循环 = 128 扩增子
循环数 1
扩增子数 (靶序列拷贝数)
2
2
4
3
8
4
16
5
32
6
64
20
1,048,576
30 1,073,741,824(10亿)
实时荧光（定量）PCR
定义：
在PCR反应体系中，加入示踪产物的 荧光分子（荧光标记的寡核苷酸探针或 荧光染料），利用荧光信号的累积对 PCR反应过程实时监控，最终对初始模 板进行定量的方法。
实时荧光定量PCR中的三个概念
• 增长曲线 (primary curve) • 荧光阈值（threshold) • CT 值(Cycle Threshold)
增长曲线 反映荧光强度与循环数的对应关系
Fluorescence
Cycle
荧光定量PCR原理
起始模板浓度的对数与C(t)值成线性反比关系
杂交探针（Hybridization Probes）模式
Fluorescein LC Red
由两条相邻的寡核苷酸探针 组成，一条探针的3’ 标记 荧光基团（供者），另一探 针的5’标记另一荧光基团（ 受者）。当退火复性时，探 针结合在模板上，供受基团 相邻，外光源激发供体基团 时，通过FRET使受体基团发 出荧光，可供检测。当延伸 时，两探针被置换，游离出 来，失去FRET结构，无可检 测荧光。在PCR的复性阶段检 测荧光
…
遗传性疾病 基因突变：单基因病 遗传风险因素
感染性疾病
病原微生物鉴定，定 量，分型，耐药检测
肿瘤
诊断，分型，治疗 检测，耐药
临床常用的分子诊断技术：
PCR扩增（临床最常用） 探针杂交技术 测序技术 片段分析技术 等
分子诊断技术：
实时荧光定量PCR技术 PCR-探针杂交技术 PCR-测序技术
临床科研常用
目标特异性探针
在PCR的延伸阶段检测荧光
RQ-PCR TaqMan探针应用：定性及定量
各种病原微生物的分子鉴定：HBV、HCV、HIV、NG、CT、 UU、HCMV、EB、TB、HPV、BKV、HSV……
血液病相关融合基因检测：BCR-ABL、PML-RARa、 AML-ETO……