体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证讲解
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④酶解法 ? 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用
酶解法。 ? 在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合
物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
22
? 超速离心法 ? 平衡透析法 ? 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
血浆蛋白结合率。
11
? 尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
? 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
? 尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
12
? 唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
1
1.为什么要对生物样品进行处理？ 2.有哪些生物样品？ 3.有哪些样品处理方法？各自的特点。 4.如何对分析方法进行验证？ 5.有哪些参考标准？
2
生物样品进行前处理的目的在于：
1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体 外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之 外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以 及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形 成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存在， 需要 分离后测定药物及代谢物 。
16
? 实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
? 若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
? 常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
17
? 优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。 ? 缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理
4
60%以上精力和花费用在样品前处理上
5
生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、 唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
6
? 全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干 扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。
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②加入中性盐 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋
白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提 取法常并用，药物的回收率较高。
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③加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形
式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有： 10%三氯醋酸等。血清与强 酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
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④加入锌盐或铜盐沉淀剂 ? 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白
质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用 的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上 清液。
13Biblioteka Baidu
生物样品的保存：
? 采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短 期保存，可 4℃冷藏；长期保存，可-20℃冷冻，不 要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
14
? 主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和 测定方法三个方面的问题。
1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE
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? 测定血中药物浓度通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度，而不是指含有血细 胞的全血中的药物浓度。
? 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、 EDTA）的试管中，混合后，3000至4000 r/min离心，分离血细胞，上清液即为血 浆。
8
血浆中含有的物质种类和比例
9
血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置1530 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清 颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白， 更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常 是相同的。
3
2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高 分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物， 也含有Na＋、K＋、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响 测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此， 为了保 护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可 靠性，必须对样品进行前处理。
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①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
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2.液液萃取法 LLE
药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物 具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质 是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基 质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物， 有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。
24
? 有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的
10
一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药 物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作 为作用部位药物浓度的可靠指标。
血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20℃的 条件，长期保存时可以保存在-80℃的条件下，是生物样品 检测中最常用的样本。
溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔
丁基甲醚和氯仿等。
? 应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、
有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。
? 酸性药物的解离：AH + H2O
A- + H+
④酶解法 ? 在测定一些酸不稳定及蛋白结合牢的药物时，常需用
酶解法。 ? 在测定尿中的药物浓度时，由于尿中药物主要以缀合
物的形式排除，较原型药物具有较大的极性，不易被 有机溶剂提取，常用酶水解的方法。
22
? 超速离心法 ? 平衡透析法 ? 最主要的应用在测定血浆中游离的药物浓度和药物的
血浆蛋白结合率。
11
? 尿液主要成分是水、尿素及无机盐类。尿样采集后，为了 保存，常会加入防腐剂。
? 体内药物清除主要是通过尿液排出，药物可以原型或代谢 物及其缀合物等形式排出。
? 尿液中药物浓度较高，但尿液浓度受尿量的影响，通常变 化较大，应测定一定时间内排入尿中药物的总量。
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? 唾液中所含成分比较简单，且容 易获得，但是只有少数药物的唾 液浓度和血浆游离药物浓度具有 相关性，实际使用不多，当药物 血浆结合率高的时候，唾液中药 物的浓度极低，很难检测。
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1.为什么要对生物样品进行处理？ 2.有哪些生物样品？ 3.有哪些样品处理方法？各自的特点。 4.如何对分析方法进行验证？ 5.有哪些参考标准？
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生物样品进行前处理的目的在于：
1．药物进入体内后，经吸收、分布、代谢，然后排出体 外。在体液、组织和排泄物中除了游离型（原型）药物之 外，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物、以 及药物或其代谢物与内源性物质，如葡萄糖醛酸、硫酸形 成的葡萄糖醛酸甙、硫酸酯缀合物等多种形式存在， 需要 分离后测定药物及代谢物 。
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? 实际应用中，多是取50uL的血浆，加入500uL的有机溶 剂，涡旋离心后，取上清进样；
? 若沉淀后，信号相应不好，可尝试更换有机溶剂或者 在沉淀时，加入酸或碱，调节pH值，可能会对结果影 响很大；
? 常用的酸碱有：盐酸，甲酸，乙酸，氨水等。
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? 优点：操作简单，为方法开发中最先考虑使用的。 ? 缺点：只使用于样品中浓度较高的药物测定；且处理
4
60%以上精力和花费用在样品前处理上
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生物样品包括各种体液和组织，但实际上最常用的是 比较容易得到的血液（全血、血浆、血清）、尿液、粪便、 唾液。在一些特定的情况下选用乳汁、脑脊液等。
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? 全血不易保存，且血细胞中含有 更多的干扰物质，影响测定，故 很少采用全血测定药物浓度。仅 适用于血浆药物浓度太低或者血 浆药物浓度波动大，且难以控制 的药物如：环孢霉素A。
后，样品中仍然会存在很多干扰物质，对结果产生干 扰；残余的杂质会堵塞色谱柱，污染仪器。
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②加入中性盐 中性盐能将与蛋白质水合的水置换出来，从而使蛋
白质脱水而沉淀。常用的中性盐：饱和硫酸胺、硫酸钠、 镁盐、磷酸盐及枸橼酸盐等。盐析的方法与有机溶剂提 取法常并用，药物的回收率较高。
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③加入强酸 当pH低于蛋白质的等电点时，蛋白质以阳离子形
式存在，加入强酸，可与蛋白质阳离子形成不溶性盐 而沉淀。常用的强酸有： 10%三氯醋酸等。血清与强 酸的比例为1:0.6混合，高速离心,就可除去蛋白质。 在酸性下分解的药物不宜用本法除蛋白。
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④加入锌盐或铜盐沉淀剂 ? 当pH高于蛋白质的等电点时，金属阳离子与蛋白
质分子中带阴电荷的羧基形成不溶性盐而沉淀。常用 的沉淀剂有：CuS04-Na2W04 ,ZnS04-NaOH等。含药物血 清与沉淀剂的比例为1:2混合，高速离心、分离后得上 清液。
13Biblioteka Baidu
生物样品的保存：
? 采样后除立即分析外，为防止药物发生变化，应：短 期保存，可 4℃冷藏；长期保存，可-20℃冷冻，不 要反复冻融，必要时可以加入酶抑制剂和抗氧化剂。
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? 主要应考虑生物样品的种类，被测药物的性质和 测定方法三个方面的问题。
1.沉淀蛋白 PPT 2.液液萃取 LLE 3.固相萃取 SPE
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? 测定血中药物浓度通常是指测定血浆或 血清中的药物浓度，而不是指含有血细 胞的全血中的药物浓度。
? 将采取的血液置含有抗凝剂（如：肝素、 EDTA）的试管中，混合后，3000至4000 r/min离心，分离血细胞，上清液即为血 浆。
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血浆中含有的物质种类和比例
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血清是在采血后不加任何抗凝剂，于室温下静置1530 min，待其自然凝结后，离心，分离出上清液。血清 颜色较血浆更浅，成分较血浆少了大部分的纤维蛋白， 更易进行处理，且血浆及血清中的药物浓度测定值通常 是相同的。
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2．生物样品的介质组成比较复杂。如在血清中既含有高 分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有机化合物， 也含有Na＋、K＋、Cl-等无机化合物。这些成分会严重影响 测定的准确性和灵敏度，同时会污染仪器。因此， 为了保 护仪器，提高测定的灵敏度，保证检测结果的准确性和可 靠性，必须对样品进行前处理。
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①有机溶剂沉淀法 加入水溶性的有机溶剂，可使蛋白质的分子内及分子间
的氢键发生变化而使蛋白质凝聚。常用的有机溶剂有：乙 睛、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、四氢呋喃等。
血浆或血清与有机溶剂的体积比为1:3时，就可以将90% 以上的蛋白质除去，采用低温高速速离心机16000r/min离 心10min 便可将析出的蛋白质完全沉淀。
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2.液液萃取法 LLE
药物在体内吸收，需经跨膜转运，所以多数药物 具有一定的脂溶性，而生物样品中大多数内源性杂质 是强极性的水溶性物质，所以可以根据药物分子与基 质之间极性的差异，使用适当的有机溶剂提取药物， 有机溶剂提取可一次除去大部分杂质。
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? 有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的
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一般认为，当药物在体内达到稳定状态时，血浆中药 物浓度与药物在作用点的浓度紧密相关，即血浆中的药物浓 度反映了药物在体内（靶器官）的状况，因而血浆浓度可作 为作用部位药物浓度的可靠指标。
血浆和血清可以稳定的冰冻保存，一般储存在-20℃的 条件，长期保存时可以保存在-80℃的条件下，是生物样品 检测中最常用的样本。
溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔
丁基甲醚和氯仿等。
? 应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、
有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。
? 酸性药物的解离：AH + H2O
A- + H+