微生物限度方法学验证

微生物限度检查
方法学验证
一、检验方法
依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。

二、菌种、培养基及稀释液
表1菌种
表2培养基
表3对照用培养基
表4试剂
稀释液：
（1）pH6.8缓冲液
取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。

（2）0.9%无菌氯化钠溶液
取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。

（3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液
取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。

（4）靛基质试液
取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。

三、菌液的制备
1细菌、霉菌、酵母菌
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。

上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

2控制菌
接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。

用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～
100cfu的菌悬液。

菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。

四、验证内容
1、计数方法验证
将制备好的菌悬液用0.9%无菌氯化钠溶液以每10倍体积分别稀释成一系列浓度菌悬液，利用血球计数板计数，确定具体菌悬液浓度，取接近于10cfu-100cfu 的稀释浓度，选取各项试验项下的规定浓度进行实验。

稀释及观察均应在阳性室内完成。

经过验证当原液稀释至10-6时，菌液浓度接近100cfu/ml。

2、适用性检查
2.1细菌、霉菌、酵母菌
取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml(内含菌约50～
100cfu)，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(内含菌约50～100cfu)，注入无菌平皿中（取用黑曲霉时应注意自身安全），立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照。

其大小、形态应与对照培养基一致，且数量应不小于对照培养基的70%。

细菌、霉菌及酵母菌培养基适用性检查
培养基中细菌、霉菌、酵母菌的生长情况良好，回收率在80%，且与对照培养基状态一致，证明此批次培养基可以准确的检测出相应微生物情况。

2.2控制菌
2.2.1促生长能力
取大肠埃希菌菌悬液0.1ml（内含菌约10～100cfu），分别置于胆盐乳糖培养基、MUG培养基、营养肉汤培养基中；取乙型副伤寒沙门菌0.1ml（内含菌约10～100cfu），分别接种于营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，取乙型副伤寒沙门菌0.1ml（内含菌约10～100cfu）涂布于胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基中；于35℃培养18小时，同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验，作为对照，每个培养基平行制备2个平皿。

胆盐乳糖培养基、营养肉汤培养基、MUG培养基与对照管比较，被检培养基管试验菌应生长良好；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基与对照培养基上生长的菌落大小、形态特征应一致。

2.2.2抑制能力
取金黄色葡萄球菌100 cfu左右，注入无菌平皿中，立即倾注胆盐乳糖培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置35℃培养18小时，应不得有菌生长。

2.2.3指示能力
取乙型副伤寒沙门菌10～100cfu，接种于三糖铁琼脂培养基中，每个培养基平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养18小时；胆盐硫乳琼脂培养基、曙红亚甲蓝琼脂培养基指示能力见2.2.1中乙型副伤寒沙门菌测试结果，MUG培养基指
示能力见2.2.1中大肠埃希菌测试结果。

与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反映情况等应与对照培养基一致。

控制菌培养基适用性检查
培养基的促生长性及指示性菌落生长状态一致，抑制性均无菌落生长，说明培养基适用性良好。

3、抑菌性：取连续生产的三批样品进行测定
3.1细菌、霉菌、酵母菌
3.1.1供试液的制备：称取本品10g，加pH6.8缓冲液100ml，混匀，制成1：10的供试液。

3.1.2试验组：取大肠埃希菌菌悬液、金黄色葡萄球菌菌悬液和枯草芽孢杆菌菌悬液各1ml，分别加上述供试液1ml，注入平皿中，立即倾注15～20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

31.3菌液组：取上述各试验菌液1ml，加入相应的培养基培养，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。

3.1.4供试品对照组：取供试液1ml，分别注入15～20ml温度不超过45℃溶化的营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基培养，每个培养基平行制备2个平皿。

3.1.5回收率标准
以供试品对照组为样品空白(C
)、以菌液组为对照(T)、以试验组为测试品(C)计：
)/T≥70%
(C-C
细菌、霉菌及酵母菌抑菌性检测结果统计
通过连续三批次不同种菌类的加样，回收率均在90%以上，说明本产品对于细菌、霉菌及酵母菌不具备抑菌性。

3.2控制菌
3.2.1大肠埃希菌
取10 ml供试液（制备方法同3.1.1）及大肠埃希菌菌悬液1ml(10～100cfu)加入胆盐乳糖培养基100ml，于35℃培养24小时。

取上述培养物0.2ml，接种至含5ml MUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。

观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液。

紫外灯照射时管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性；加入靛基质试液时液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。

3.2.2沙门氏菌
取10 ml供试液（制备方法同3.1.1）及乙型副伤寒沙门菌1ml(10～
100cfu)，直接接种至200ml的营养肉汤培养基中，混匀，于35℃培养培养24小时，取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，35℃培养24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂培养基和曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上，35℃培养24小时。

3.3合格标准
若上述试验检测出试验菌，则按此供试液制备方法和控制菌检查方法进行供试品的该控制菌检查。

控制菌抑菌性检查
经控制菌的验证，当样品被1:10稀释时，本品不具有抑菌性，可以直接采用平皿法进行检验而不对检测结果造成假阴性的影响。

五、本品微生物限度检查方法的确定
综上所述，本品细菌、霉菌及酵母菌检查采用常规平皿法，取1：10稀释级供试液1ml置90mm的无菌平面皿中，注入15～20ml培养基进行培养；大肠埃希菌按常规法检验。

1ml供试品中，细菌数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌数不得过
100cfu，大肠埃希菌不得检出；每10ml不得检出沙门菌。

六、样品微生物限度检查结果
取3批样品，按验证过的方法进行微生物限度检查，结果如下。

微生物限度检查结果
批号细菌数
（cfu/ml）霉菌和酵母菌数
（cfu/ml）
大肠埃希
菌
沙门菌
生产验证150804100<10 未检出未检出15080550<10未检出未检出15080660<10未检出未检出
结果，三批样品的微生物限度均符合规定。