α-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

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（ -0>?>@9 A@BC>CDC0 EF /GH@BFDB>E@ I0J>K>@0，-0>?>@9 ’##(&# ，,L>@H） ［ "3#(4$0(］ ! 536’0(12’： /E 0BCHM1>BL H ;0CLEJ CLHC KH@ M0 DB0J FEG CL0 NG0K>B0 J0C0G;>@HC>E@ EF !2O29H1HKCEB>JHB0 HKC>P>2 CQ5 7’()*+： RGEJDKCB NGEJDK0J MQ !2O29H1HKCEB>JHB0 S0G0 J0C0KC0J MQ ;0H@B EF BN0KCGENLECE;0CG>K ;0CLEJ，SL>KL KED1J M0 DB0J CE 0PH1DHC0 !2O29H1HKCEB>JHB0 HKC>P>CQ5 8’#9/(#： /L0 G0BD1CB BLES0J CLHC CL0 PHG>HM>1>CQ S>CL>@ MHCKLB SHB "5 $+6 H@J CL0 PHG>HM>1>CQ M0CS00@ MHCKLB SHB .5 ."6 5 /L0B0 >@J>KHC0J CLHC CL0 ;0CLEJ SHB G01>HM10 CE KED1J M0 DB0J >@ !2O29H1HK2 CEB>JHB0 HBBHQ5 :*;0/9#1*;： /L0 ;0CLEJ LHB CL0 ;0G>CB EF L>9L NG0K>B>E@，9EEJ G0NGEJDK>M>1>CQ H@J 0HBQ EN0GHC>E@，BE >C KH@ M0 DB0J FEG J0C0KC>@9 !2O29H1HKCEB>JHB0 HKC>P>CQ 0THKC1Q5 ［ <’% =*4+#］! !2O29H1HKCEB>JHB0；HKC>P>CQ HBBHQ； BN0KCGEBKEN>K H@H1QB>B ! ! !2半乳糖苷酶 （ !2O29H1HKCEB>JHB0，343 ） 属外切糖苷酶 类， 可特异性地水解多糖、 糖脂、 糖蛋白中糖链末端的 !2半
>A @A @? 蛋白含量测定! -,3 法测 343 的蛋白含量， 以 -V3
>? 材料和方法
> 5 >? 材料与试剂 > 5 > 5 > ? 材 料 与 设 备 ! 对 硝 基2苯 基2!2O2吡 喃 半 乳 糖 苷 （ RWR4） 和对硝基苯酚 （ RWR ） 为 V>9;H 公司产品， -,3 蛋白 定量试剂盒购自 R>0GK0 公司， 其他试剂为国产分析纯。紫
#% 结果
# . !% 最佳反应条件的选择 # . ! . !% 最佳反应时间的选择! 取 "" 个小试管， 加入 ’ ( 测 活缓冲液 )%& !$、 ’ ##2$ 3 8 的底物 %&& !$、 水 %& !$， )*+ 孵 育 "& #,- 以上， 然后加入 )*+ 的 "9半乳糖苷酶的水溶液 （蛋 )&& !（ $ 各管操作依次相隔 ) #,- 进 白浓度为 &. &" #: 3 #$ ） 行） ， )*+ 孵育， 分别于 % ， "& ， "% ， )& ， )% ， ;& ， ’& ， %& ， *& #,- 取 出 &. % #$ 加入 %. % #$ 的终止液中终止反应， 用紫外9可见分 光光度计测定 ’&% -# 的光密度值。结果在 )& #,- 内酶反应 速度是恒定的， 此间酶活力与对硝基苯酚的生成量成正比。 本实验选定的酶促反应时间为 "& #,-。 # . ! . #% 最适反应 01 的选择 ! 最适反应 01 为 *. ’ ， 参见文 献 ［<］ 。 # . ! . $% 底物浓度的选择! 取 "’ 个小试管， 加入 ’ ( 测活缓 冲液 )%& !$、 不同浓度 （ & = "& ##2$ 3 8 ） 的 底 物 %&& !$、 水 %& !$， )*+ 孵育 "& #,- 以上， 然后加入 )*+ 的 "9半乳糖苷 酶的水溶液 （ 蛋白浓度为 &. &" #: 3 #$） )&& ! （ $ 各管操作依次 相隔 ) #,- 进行） ， )*+ 孵育 "& #,-， 迅速从中取出 &. % #$ 加 入%. % #$的终止液中终止反应， 用紫外9可见分光光度计测 定 ’&% -# 的光密度值。根据图 " ， 底物浓度在 " = ’ ##2$ 3 8 时， 酶促反应进入平台期。确定底物的浓度为 ) ##2$ 3 8。 # . #% 反应产物的特异性 为了检查酶促反应体系中所生成的产物是否是 565， 测 定了酶促反应产物在不同波长下的光密度值， 结果表明， 反 应产物在 ;>% = ’"& -# 处有最大吸收峰。与标准品的吸收 光谱一致 （ 图 )） ， 说明在 ’&% -# 波长下所测得的光密度值 可表示反应体系中 565 的生成量。 # . $% 批间、 批内精密度 同一批酶按照上述酶活检测方法重复测 * 次， 每次 "& 管， 计算批内变异系数， * 次 ?@? 活性测定结果的平均值之
［’］ 乳糖苷键 。在人、 动物、 植物及微生物Байду номын сангаас内均存在 343。
外2可见分光光度计 XY2’"## 为北京瑞丽分析仪器公司制 造。 > 5 > 5 @? 试剂配制 ! . Z 测活缓冲液 （ N[ $5 . ） ： 称取磷酸氢 二钠・’"[" U ))5 " 9， 柠檬酸・[" U ’"5 )" 9， 溶于水后， 定容 至 &## ;1。 底物贮存液： ’" ;;E1 : \ 的对硝基2苯基2!2O2吡喃半乳 糖苷水溶液。 终止液： #5 " ;E1 : \ 硼酸2氢氧化钠溶液 （ N[ )5 ( ） 。 >A @? 方法 >A @A >? 343 的制备 ! 343 是基因重组的酵母工程菌发酵 产物， 经超滤、 阳离子交换、 疏水层析、 阴离子交换纯化后， 保
［$］ 存于 .] 备用 。
重组的 343 被广泛应用于农产品加工、 人 - $ U 血型改造 制备通用型血、 清除动物及人之间的主要异种抗原以及治疗
［" 8 &］ 。此前， 我们报道了重组咖啡 遗传性疾病法布莱氏病等
豆 343 的 活 性 测 定 方 法
［$， *］
， 该 方 法 以 市 售 咖 啡 豆 343
［ 收稿日期］ ! "##$ % #& % ’( ［ 基金项目］ ! 国家重点基础研究发展规划 （ “ )*+ ” 计划） （ "##",-*’+(#. ） ［ 作者简介］ ! 高红伟 （ ’)*$ % ） ， 女， 山东省茌平县人， 硕士， 助 理研究员。 /01： #’#2$$)+’&.& !通讯联系人，
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!!半乳糖苷酶活性测定方法的研究
技术方法
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为标准物。 !" #" $% 酶活性的测定! 在总体积为 " #$ 的反应体系中， 加 入底物 %&& !$， ’ ( 测活缓冲液 )%& !$， 水 %& !$， )*+ 孵育 "& #,- 以 上， 加 入 适 当 稀 释 的 酶 液 )&& !$， 于 )*+ 孵 育 "& #,-后， 取 %&& !$ 立即加入%. % #$ 终止液中终止反应， 于 ’&% -# 处测定光密度值。同时设置底物对照和酶液对照。 产物对硝基苯酚显黄色， 在 ’&% -# 处有最大吸收峰。 " / 定义： “ 在 )* + ， 以最适底物浓度， 最适 01 等条件 下， " #,- 内生成 " !#2$ 底物的酶量为一个酶活性单位。 ” 酶活性计算公式： ! （ / 3 #$）4 " ( ) ( #$ % ( & ( ’$
（ V>9;H， ;< =%>+ 表达产物） 作为标准品， 绘制标准曲线， 根据 此外， 标准曲线确定待测 343 的活性。但标准品价格昂贵， 由于应用酶标仪方法检测时反应体系体积小 （ .# "1 ） ， 测活 误差较大。本研究在此基础上， 对 343 的测活方法进行改 进， 建立了一种简单易行的、 应用光谱分析法测定 343 活性 的实验方法。