基因转移技术ppt课件

基本原理：通过动力系统将带有基因的金属颗 粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一 定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强， 故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从 而实现稳定转化的目的。 优点：具有应用面广，方法简单，转化时间短， 转化频率高，实验费用低等优点。对于农杆菌 不能感染的植物，采用该方法可打破载体法的 局限。
基因转移技术的应用

外源基因与载体在体外重组形成重组DNA分子 后，为了分析基因的表达，测定表达对细胞生 长的影响，研究该基因的结构与功能，得到高 表达的基因产物，通常需要将重组DNA分子通 过特定的方法导入宿主细菌（细胞）。
基因转移技术的分类：

第一类是将目的基因转导入体外培养的细胞或导入从 体内取出的细胞，观察目的基因在细胞中的表达，这 项技术称基因转染(gene transfection )技术。通常情 况下，该技术转入的目的基因不与细胞染色体发生整 合，而是在细胞质呈现暂时性表达，随时间推移而逐 渐减弱或消失。为了使目的基因进入细胞后能与细胞 基因组DNA发生整合、产生永久性的表达，需用病毒 载体将目的基因导入细胞，并发生整合；
三、基因枪法(gene gun)
该法又称粒子轰击(particle bombardment)， 高速粒子喷射技术(High-velocity particle microprojection)或基因枪轰击技术(gene gun bombardment)，是由美国Comel大学生物化 学系John.C.Santord等于1983年研究成功。
基因转移技术
概述

运用物理、化学或生物学的方法和技术将外源 基因转移到受体细菌或者细胞内，并使之在细 菌或细胞内实现转入基因的扩增好表达称为基 因转移技术。它是重组DNA技术和基因治疗 的关键步骤之一。
两个概念


转化：质粒DNA或其他载体与目的基因DNA 构建的重组载体导入宿主细胞的过程。 转染：噬菌体，病毒或以其他作为载体构建的 重组载体导入宿主细胞的过程。
第二节、化学转染法


利用化学物质对细胞或DNA分子进行处理和 修饰，以使外源性DNA顺利进入细胞内的方 法。 包括： 1.氯化钙转移法 2.DNA-磷酸钙共沉淀法 3.DEAE-葡聚糖转染技术 4. 脂质体转染法(liposome)
1.氯化钙转移法


感受态细胞（competent cell）：理化方法诱 导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的 生理状态。 目前常见的感受态细胞的制备方法有 CaCl2 ,RbCl2法， RbCl2发制备的感受态细 胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行。
（2）操作程序

将盛有细胞和 DNA混合液的特制小容器置于 电泳冲仪的正负电极之间，在 0 ℃下加高压 (2.0～4.0kV)电脉冲 10分钟后，将处理的细胞 转移到新鲜培养基中生长 2天，再行筛选。电 穿孔之前若用秋水仙酞胺(colcemid)预处理细 胞10小时，可提高转化效率3～10倍。
(3)影响因素

它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方 法， 1.可直接用不含有原核载体DNA片段的外 源基因进行转移； 2.外源基因的长度不受限制, 可达100kb ； 3.实验周期相对比较短。
二、电穿孔法(Electroporation)

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电穿孔(electroporation)是指在高压电脉冲的作用下 使细胞膜上出现微小的孔洞。从而导致不同细胞之间 的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。几乎所 有类型的细胞，包括植物的原生质体、动物的初生细 胞，以及不能用其它方法(诸如磷酸钙或DEAE-葡聚糖 法)转染的细胞，都可以成功地使用电穿孔技术进行基 因转移。此项技术具有操作简便，基因转移效率高等 优点。
在1987年，Vlein首先报道了应用此技术将 TMV（烟草花叶病毒）RNA吸附到钨粒表面， 轰击洋葱表皮细胞，经检测发现病毒RNA能进 行复制，并以同样技术将CAT(Chloraphericol acetyltransferase氯霉素乙酰转移酶基因)基因 导入洋葱表皮细胞。现在，该技术已在烟草、 水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜 豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上 成功。
第一节、基因转移的物理学方法
主要有: 1.显微注射法 2.电穿孔法 3.基因枪法
一、显微注射法(Microinjection)

受体细胞主要是卵细胞， 现在也用于贴壁细胞 成功率与操作者的熟练 程度有关 主要用于转基因动物

显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射 技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核 中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内， 再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精 卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转 基因动物。
（1）基本原理

在高压电场的作用下，细胞膜因发生临时性破裂所形 成的微孔，足以使大分子以及像ATP这样的小分子从 外界进入细胞内部，或是反向流出细胞。细胞膜上微 孔的关闭是一种天然衰减的过程，在0℃下，这种过 程会被延缓进行。 在微孔开启期间，细胞外环境中的核酸分子便会 穿孔而入，并最终进到细胞核内部。具有游离末端的 线性DNA分子，易于发生重组，因而更容易整合到寄 主染色体，形成永久性的转化子。超盘旋的DNA比较 容易被包装进染色质，因此一般说来它对于瞬时基因 表达的实验更为有效。

第二类是将已克隆的目的基因导入受精卵，并 将导入基因后的受精卵植入子宫，发育成胚胎 和个体，胚胎期和出生后均可观察目的基因在 整体内的表达，此项技术称转基因技术 （transgenic technique），转基因技术所产 生的动物称转基因动物(transgenic animal)。
1.基因转移的物理学方法 2.基因转移的化学方法 3.基因转移的生物学方法

脉冲的最大电压和脉冲持续的时间，是影响电 穿孔转染效率的两个主要因素，而与DNA浓度 则无多大关系。 电穿孔转染效率主要取决于所用的细胞类型。 对于不适合用传统方法转染的细胞，用电穿孔 法得到的永久转化的频率约为10-4～10-5之间。

可用于真核、原核细胞的转染 优点：简单、重复性好、转移效率高 缺点：对细胞有损伤