分子生物学常用实验指南
常见分子生物学实验方法 ppt课件3篇
常见分子生物学实验方法 ppt课件1. 基因克隆实验方法基因克隆是指将一个或多个基因从一个生物体中分离出来，置于另外一个生物体中，并且使其在新宿主中表达，从而获得大量的目标基因产物。
（1）限制酶切割法：将质粒和目标基因使用限制酶切割，得到可互相配对的切口。
将它们接合形成重组质粒，转化至大肠杆菌中进行筛选。
（2）聚合酶链式反应（PCR）：利用DNA聚合酶在一定温度下对DNA模板进行扩增、重复，PCR可使目标DNA扩增数千倍，成为细胞操作或其他实验的良好基础。
（3）DNA定向克隆：利用DNA复制的属性和DNA酶的活性，通过向目标DNA的特定区域加入赋予重组性的核酸片段向目的基因主导特定区域，达到目标的DNA定向克隆效果。
2. mRNA分析实验方法mRNA分析是分析mRNA信使分子的性质、结构、功能等方面的实验方法。
（1）Northern印迹：通过RNA电泳的方式分离RNA，将RNA转移至硝酸纤维素膜，并与适当的标记DNA进行杂交，利用核酸杂交进行检测和鉴定。
（2）RT-PCR（即逆转录PCR）：将mRNA逆转录，合成cDNA，然后通过PCR技术进行扩增，是检测mRNA表达量的常用手段。
（3）荧光原位杂交（FISH）：将荧光探针与特定控制序列杂交，可以在组织或细胞水平发现目标mRNA的位置和表达情况，可得到细胞表达局部和过程的信息。
3. 蛋白质表达实验方法蛋白质表达是分析分离和检测目标蛋白质的方法。
（1）重组蛋白质表达：在大肠杆菌或哺乳动物细胞中表达重组蛋白质，为研究蛋白质的结构和功能提供重要材料。
（2）GST标签蛋白质表达：将GST蛋白质与目的蛋白质融合，通过分离纯化GST标签蛋白质，可同时分离纯化目的蛋白质，比其他表达和纯化蛋白质的方法更高效。
（3）蛋白质印迹（western blot）：将分离出来的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶并与特定抗体结合，从而检测蛋白质的表达水平和效率等信息。
以上是分子生物学实验方法的三个方面，从基因水平到蛋白质水平进行了简单的介绍。
分子生物学实验指南.pdf
RT-PCR
Protocol: TaKaRa One Step RNA PCR Kit (AMV) 1. 按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液
Reagent
Quantity, for 50µl of reaction mixture
10×One Step RNA PCR Buffer
5µl
25 mM MgCl2
的 wash buffer； 6. 将纯化柱放入一个新的 EP 管。加 30~40µl H2O 或者 elution buffer 至纯化柱膜的中央，在
37℃或 50℃下放置 2 分钟，10,000rpm 离心 1 分钟洗脱 DNA，将 EP 管中的 DNA 溶液放 在-20℃保存。 7. 注：若想要不电泳而直接纯化 DNA 溶液，只需要在第 2 步中按 100µl 液量加 400µl 的 binding buffer,其余的步骤不变。
物的大小
Taq 酶 每 分 钟 延 伸 1000bp
最终延伸
72
10
1
反应结束后，抽取扩增样品 5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用 DNA marker 判 断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。
琼脂糖核酸电泳
1. 用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子； 2. 根据欲分离 DNA 片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖
5. 在最大转速下离心 5min，取上清液于另一新 EP 管； 6. 用两倍体积的乙醇室温沉淀双链 DNA，振荡混合于室温放置 2 分钟，最大转速离心 5 分
钟；
7. 小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴 除尽；
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学实验实验操作
2μL
rhIL-18双酶切产物
X μL
质粒pUC18双酶切产物
Y μL
T4-DNA连接酶
1μL
20℃1h，4 ℃过夜
感受态菌的制备
（1）E.coli DH5α菌株37℃过夜培养以复苏菌种，取过夜培养的菌液 0.3mL加入到30 mL LB培养基中，37℃，230 r/min振荡培养3 h， 至OD600约为0.4左右。
4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱 放入同一个收集管中，加入500μL Wash Solution， 12000 rpm 室温离心 1 min。
5.重复步骤4一次。
6.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放入 同一个收集管中，12000 rpm 室温离心 2 min。
胶成像分析结果。
分子生物学实验实验操作
基因、载体、受体菌株
基因 PCR
酶切连接
质粒
质粒提取
载体 转化
菌株
实验流程: 第二天
凝胶回收与溶液回收 电泳检验
T4连接酶连接过夜
E .coli DH5α菌株 37℃过夜培养
实验流程: 第三天
提取质粒DNA 浓度1%琼脂糖凝胶电泳
实验流程: 第四天
PCR 浓度1%琼脂糖凝胶电泳
用 1.0mL 预 冷 的 0.1mol/LCaCl2 溶 液 重 悬 细 胞 沉 淀 ， 200μL/ 管 分 装 。
pUC18-hIL-18重组质粒的转化
（1）向分装有200μLE.coli DH5α菌株感受态细胞的EP管中 加入10μL的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内 容物，冰浴上放置30 min。
0.5μL
分子生物学操作手册
分子生物学操作手册一、引言分子生物学是研究生物体分子结构、功能和相互作用的一门学科。
操作手册旨在提供分子生物学实验的详细步骤，并帮助读者准确、高效地进行实验操作。
本文将介绍PCR扩增、DNA电泳、亚克隆和蛋白质表达等实验步骤，并提供一些常用操作的技巧和注意事项。
二、PCR扩增PCR扩增是分子生物学实验中常用的技术，用于扩增特定区域的DNA片段。
以下是PCR扩增的基本步骤：1. 准备PCR反应体系：根据实验需要，配置PCR反应液，包括DNA模板、引物、酶、缓冲液和dNTPs等。
2. 设定PCR程序：根据模板序列的长度和引物的特性，设定合适的PCR程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
3. PCR反应：将PCR反应体系置于热循环仪中，按照设定的程序进行PCR反应。
4. 结果分析：利用DNA电泳等技术，分析PCR反应产物的大小和纯度。
三、DNA电泳DNA电泳是一种常用的DNA分析技术，用于确定DNA片段的大小和纯度。
以下是DNA电泳的基本步骤：1. 制备琼脂糖凝胶：根据需要，配制适当浓度的琼脂糖凝胶，并倒入凝胶槽中，形成凝胶床。
2. 加载样品：将PCR扩增产物或其他DNA样品与DNA标记物混合，加入琼脂糖凝胶孔中。
3. 进行电泳：将凝胶槽放入电泳仪中，进行电泳操作，根据需要设置适当的电压和时间。
4. 结果分析：利用紫外线透射仪观察凝胶上DNA迁移的情况，测量DNA片段的大小。
四、亚克隆亚克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，通常用于构建重组DNA或进行基因克隆。
以下是亚克隆的基本步骤：1. 准备载体和DNA片段：准备含有目标基因的DNA片段和经酶切的载体DNA。
2. 消化与连接：将DNA片段与载体DNA进行连接反应，通常使用DNA连接酶。
3. 转化：将亚克隆反应产物转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选与鉴定：通过筛选培养基和PCR等技术，鉴定含有目标基因的克隆。
五、蛋白质表达蛋白质表达是将目标蛋白质在细胞内大量合成的过程，利用该技术可以生产重组蛋白以供研究和应用。
分子生物学常用实验方法与基本仪器操作
显微镜操作
要点一
总结词
显微镜是用于观察细胞和组织的形态、结构和动态变化的 仪器。
要点二
详细描述
选择合适的显微镜物镜和目镜，调节焦距和光源等参数， 将样品放置在载玻片上并放入显微镜的观察台上。通过目 镜观察样品的形态和结构，可以配合使用染色、标记和荧 光等技术进行更深入的分析。显微镜操作时需要注意保护 眼睛和保持清洁等事项。
利用限制性内切酶对DNA进行切 割，产生特定长度的DNA片段， 常用于基因定位、基因组测序等 。
电泳技术
利用电场对带电粒子进行分离的 技术，常用于DNA、RNA和蛋白 质的分析和分离。
分子杂交与印迹技术
分子杂交
利用互补的核酸序列通过杂交反应检 测特异性的核酸序列，常用于基因诊 断、基因表达分析等。
根据实验需求设置PCR仪的循环参数，如 变性、退火、延伸等温度和时间。将PCR 反应液放入PCR仪的样品槽中，盖上盖子 并启动程序。等待PCR程序运行完成，取 出扩增产物进行后续分析。PCR仪操作时 需要注意温度控制和防止污染等事项。
电泳仪操作
总结词
电泳仪是用于分离和检测DNA、RNA和蛋白质等生物分子的仪器。
加强实验室管理
建立严格的实验室管理制度，确保实验室环 境、仪器和试剂等符合要求。
THANKS
基因克隆与PCR技术
01
基因克隆
02
PCR技术
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过连接酶将目的基因片 段连接到载体上，最后将重组的DNA导入宿主细胞进行扩增和筛选 。
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
分子生物学实验技术使用指南
分子生物学实验技术使用指南背景随着生物科技的飞速发展，分子生物学实验技术变得日益重要。
无论是基础研究还是应用研究，分子生物学实验技术都扮演着关键角色。
本文将深入探讨几种常用的分子生物学实验技术，并提供使用指南。
1. DNA提取技术DNA提取是分子生物学实验中的第一步。
合理高效的DNA提取可以确保后续实验的顺利进行。
常用的DNA提取方法包括Phenol/Chloroform法、Qiagen柱法等。
对于不同的样品类型，选择合适的方法非常关键。
例如，对于植物样品，除了常规提取方法外，还可以使用植物基因组DNA提取试剂盒进行快速提取。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学实验中的常用技术。
它使得我们能够在实验室中迅速扩增DNA片段。
在PCR过程中，引物的设计非常重要。
合理严谨的引物设计能够提高扩增效率，并避免非特异扩增。
此外，选择适当的扩增条件和酶的浓度也是成功PCR实验的关键。
3. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化可以用于DNA片段的切割和鉴定。
合理选择适合的限制酶是至关重要的。
在消化反应中，反应的时间和温度是需要特别注意的因素。
此外，对于限制性内切酶的消化产物的鉴定，可以使用琼脂糖凝胶电泳或PCR扩增来进行。
4. 基因克隆技术基因克隆是分子生物学实验中常用的技术手段。
在基因克隆过程中，选择合适的酶切位点和载体是至关重要的。
克隆之前，需要仔细设计引物以扩增目标基因。
成功克隆后，还需要验证所克隆基因的准确性。
这可以通过测序和进一步的功能检测来完成。
5. 蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术是研究蛋白质表达和相互作用的重要技术。
在进行免疫印迹实验前，需要制备合适的细胞裂解液来提取蛋白质。
之后，需要将蛋白质样品进行分离，并转移到膜上。
此外，合适的抗体选择和浓度优化也对实验结果有重要影响。
6. 基因组测序技术基因组测序是分子生物学研究中不可或缺的技术。
高通量测序技术的发展使得基因组测序变得更加快速和准确。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
生命科学系2011-2012学年度分子生物学实验（0801班）2011-2012学年度分子生物学实验指导实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3)实验二质粒DNA的转化 (4)实验三质粒DNA的提取 (5)实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7)实验五PCR基因扩增 (9)实验六DNA重组 (10)实验七蓝白斑筛选实验 (11)实验八DNA酶切技术 (13)实验一大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。
我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。
因而具备了吸收外源DNA的能力。
三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪四、材料与试剂：1.大肠杆菌top10菌株2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL3..LB液体及固体培养基4.50%甘油500mL（灭菌）五、实验操作步骤：1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中，37℃振荡（200r/min）培养过夜。
2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600应在0.4～0.5之间)3.将菌液置冰浴中10min。
（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷）4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。
5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保温30min。
6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100µL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、100µL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
实验二质粒DNA的转化一、实验目的：掌握质粒DNA的转化技术二、实验原理: DNA能够黏附于感受态细胞的表面，经过42℃短时间的热激处理可以促进DNA的吸收。
转化菌在非选择培养基中保温一段时间后，质粒DNA所携带的抗性基因（Amp r）得到表达，然后再在选择培养基上培养，使转化的菌株得以正常生长。
三、仪器：1.超净工作台 2. 恒温摇床 3.恒温水浴四、1.材料与试剂：LB培养基（液体、固体平板）2.感受态3.无菌水五、实验操作步骤：1.200µL新鲜制备的感受态细胞，加入质粒DNA2µL（约5～50ng）混匀，冰上放置30min。
同时做一对照试验：200µL感受态+2µL无菌水，其他操作同上述实验完全一样。
2.将上述管放到42℃水浴中，精确计时90秒。
3.冰浴2min。
4.复苏：管中加入LB液体培养基800µL，37℃培养1h（50r/min）5.涂平板：取200µL复苏细胞，涂布于含AMP的LB培养基上。
待大约30min，让菌液被培养基吸收。
6.菌落培养：倒置平皿，37℃培养12～16h，转化子即可长成菌落。
照相。
实验三质粒DNA的提取一、实验目的：掌握碱裂解法提取质粒的技术和方法二、实验原理碱裂解法提取质粒利用的是环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低至中性后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
三、仪器、材料与试剂(一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．漩涡混合器(二)材料与试剂材料：带有pGEM-T质粒的大肠杆菌试剂：1. Solution I [50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris.HCl（PH8.0）,10mmol/L EDTA(PH8.0)]2.. Solution II（0.4mol/L NaOH+2%SDS用前等体积汇合）3. Solution III (5mol/L乙酸钾60mL,冰乙酸11.5 mL,DH2O28.5mL)4. TE缓冲液 (PH8.0)[10mmol/L Tris.HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)]5. 0.5mo1／L (EDTA)6. 氯仿：异戊醇（24：1）7. Tris饱和酚：氯仿：异戊醇（25：24:1体积比）8. RTE (含20µg/mLRNA酶A的TE缓冲液)四、实验步骤1. 将3mL含Amp的LB液体培养基加入到试管中，接入含pGEM-T质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜；2.将菌液加入1.5mL离心管中，4000r/min,5min,弃上清；重复一次，增加菌的收集量；3.在离心管中加入100µL溶液I,涡旋混匀，室温放置10min；4.加入200µL溶液II，轻轻混匀（颠倒5～10次），待逐渐变清亮后，冰浴2min（操作要轻柔，裂解时间不要超过5min）；5.加入150µL溶液III（冰上预冷的）加盖，轻轻颠倒混匀数次。
在冰上静置15min 让质粒DNA复性；6.12000r/min离心10min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中；7.向上清中加入等体积（约450µL）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）（去蛋白质和脂肪），手摇混匀，12000r/min离心5min，将上清移到另一个新的1.5mL离心管中（操作要平稳，不要将下边的有机相带上来）；8.向上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1）（去微量酚和脂肪），轻轻颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清移入另一个1.5mL的离心管中（不要将下边的有机相带上来）；9.向上清中加入2倍体积的无水乙醇（冰冷的），混匀后，室温放置10min。
12000r/min 离心10min，弃上清；10.加入1mL冰冷的70%乙醇，吸打悬浮，12000r/min离心2min，再重复一次。
将离心管中的乙醇倒净，倒扣在滤纸上吸干，再置超净台上15min，让酒精挥发干净；11.加20µLRTE(含有RnaseA20µg/mL的TE缓冲液)，使质粒溶解，-20℃保存。
实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA一、实验目的：掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术与方法二、实验原理：DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA 分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双涟DNA 几乎具有等量净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。
具有不同的相对分子质量的DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。
凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子（以质粒为例，一般情况下迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环）。
三、仪器、材料与试剂(一)仪器1.琼脂糖凝胶电泳系统2. 凝胶成像系统(二)材料与试剂材料：1.pGEM-T质粒DNA（含PODa基因3’片段）（是实验三的回收产物）2.琼脂糖3.ＥＢ（溴化乙锭）试剂：1.5×TBE2.6×loading-buffer(加样缓冲液)四、实验步骤1.制备1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入20mL0.5×TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全融化，取出摇匀，室温下降温至60℃左右，开始制胶板；2.胶版制备：将有机玻璃内槽洗净晾干，放置一水平制胶器中，并放好样品梳子，待凝胶放凉至60℃左右时，缓缓倒入有机玻璃内槽（注意，不要形成气泡）即成胶板，室温下凝固约30min，将有机玻璃内槽放入电泳槽内（注意方向：加样孔远离电泳槽的正极端）。
3.加电泳液：将0.5×TBE缓冲液加入电泳槽内，刚好淹没凝胶平面，轻轻拔出梳子。
4.加样：取DNA 2µL+DDH2O3µL+6×loading-buffer1µL，混匀后用移液枪加入加样孔。
记录加样的顺序。
通常第一泳道加样为DNA Mark。
5.电泳：电压一般不超过5V/cm，注意电极的方向不能错了，DNA向正极移动。
当溴酚蓝移动到凝胶前沿约2cm时，停止电泳，切断电源。
6.染色、照相：戴上手套，将凝胶移入盛有0.5µg/mL EB的染色盘中，染色5min，在移入蒸馏水中漂洗5～10min，洗掉多余的燃料，然后转入凝胶成像系统照相。
操作中谨防EB污染。
五、试验结果注意观察DNA的分子量大小，估计DNA的含量，推测出样品DNA的浓度，观察质粒的3种构型，分析质粒DNA的质量，判断可否作为下一步基因重组的材料？实验五 PCR基因扩增一、实验目的：掌握PCR反应的基本原理和实验技术二、实验原理：PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控等许多方面。
三、仪器、材料与试剂：1.PCR仪；凝胶电泳及凝胶成像系统；Taq酶及其Buffer；PCR管2. PCR反应成分：①.模板DNA：实验三提取的质粒DNA（含Poda3’） 2ul (浓度高的稀释5倍后)②.引物: poda3’P1 (10umol) 1ul③.引物： poda3’P2 (10umol) 1ul④.dNTP：（each 2.5mmol） 4ul⑤.反应缓冲液： 10×plus Buffer 5ul⑥.DNA聚合酶： Taq plus Polymerase 2ul⑦.DD H2O 35ul四、PCR反应基本步骤：①.94℃预变性 5min；②.94℃变性 40S；③.61℃退火40S；④.72℃延伸 60S;⑤.重复②～④步35次；⑥72℃延伸5min；⑦4℃保存4min；⑧end。