常见分子生物学实验方法

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PET-28a
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真核生物表达载体
真核生物表达载体的结构单元: 复制起点(真核和原核) 克隆位点
筛选标记(原核和真核标记)
增强子/启动子﹡
PolyA ﹡
终止信号
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目的基因的获得
公司合成
目的基因的获取方法
同行馈赠
RT-PCR
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另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键。
常用的DNA连接酶有两种:
来自大肠杆菌的DNA连接酶
来自噬菌体的T4DNA连接酶。
二者的作用机理类似
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T4连接酶作用分三步:
(1)T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物。
(2) 酶-AMP复合物结合到具有5’-磷酸基和3’-羟基切 口的DNA上,使DNA腺苷化。 (3) 产生一个新的磷酸二酯键,把缺口封起来。
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注意事项
所提取的RNA不能有降解,要达到最佳扩增,所 需的总RNA的量是必需的。 Taq酶、Rnasin等-20℃保存,操作时臵于冰上; dNTP保存在 4度即可,勿反复冻融。 在操作过程中实验者必须戴消毒手套,并经常更 换,确保无RNase的污染。
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细胞放入42C 的温水中保温 1.5 分钟以增加转化效率的过程.
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重组子的筛选与鉴定 外源DNA 连接 载体DNA
重组分子
转化 转染
原核细胞 扩增或表达
受体细胞 真核细胞 表达
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在DNA体外重组实验中,外源DNA片段与载体DNA的 连接反应物一般不经分离直接用于转化,再加上重组率和 转化率的不理想,因此必须通过筛选和鉴定来区分转化子 与非转化子、重组子与非重组子。 转化子:接纳载体或重组分子的转化细胞。
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T-vector PCR产物亚克隆载体
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原核生物表达载体
原核生物表达载体的基本结构单元包括: 复制起点
克隆位点
筛选标记 启动子﹡ 转录终止序列﹡ 核糖体结和位点:起始密码子ATG和SD序列(翻译识别)
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产物的电泳和结果的测定
琼脂糖浓度(%)
根据产物长度制作适宜 浓度的琼脂糖凝胶:
线性DNA片段的有 效分离范围(kb) 1 - 30 0.8-12 0.5-10 0.4-7 0.2-3
0.5 0.7 1 1.2 1.5
取适量PCR产物,加上样缓冲液充分混合,点样于事先 做好的琼脂糖凝胶点样孔中,10V/cm电泳45-60min。 成像系统成像分析。
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影响核酸限制性内切酶活性的因素
(1)DNA 纯度
(2)DNA甲基化的程度
(3)酶切消化反应温度
(4)DNA的分子结构 (5)限制性内切酶的缓冲液
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DNA连接酶与DNA分子的体外连接
DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现 的。它是一种封闭DNA链上缺口酶,借助ATP 或NAD水解提供的能量催化DNA链的5‘-PO4与
用本制品可大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
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T-vector 克隆PCR产物时用高效连接液Ligation Solution I 可以在极短的时间内 (30分钟~1小时) 完成连接反应,大大 地方便了实验操作。 用途:克隆PCR产物。 对克隆后的PCR产物使用M13 primers进行DNA测序。
94℃预变性 94℃变性
5分钟 30秒
57℃退火
72℃延伸
30秒,共30个循环
30秒
72℃延伸
5分钟
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PCR条件的优化
引物退火温度的调节,一般在引物设计软件推荐 温度的上下2 ℃变化寻找最佳退火温度。 Mg2+浓度的调节也非常重要,通常最佳浓度为 2mM左右。 引物和模板的量等。
由于基于载体遗传的筛选与鉴定程序不能区分期望重组子与非期望重 组子。在大多数情况下,待克隆的目的基因或DNA片段的序列至少 部分是已知的,因此根据克隆片段序列设计的筛选与鉴定程序具有广 泛的实用性
常见分子生物学实验方法
分子生物学实验的重要性
1,分子生物学技术在目前医学科学研究中占主导地位,几乎 所有基础类SCI文章都涉及分子生物学实验,掌握分子生物学 实验技术的理论和方法有助于读懂基础类SCI文章; 2,对许多医学研究生来说,分子生物学实验技术是他们完成 实验研究最为常用的一种工具和达到目的的一种手段。
载体,作为一个克隆载体最
基本的要求都具备: 复制起点:Origin 克隆位点:EcoR I; Hind III; BamH I; Sal I 筛选标记:Ampr。
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质粒载体分类
克隆载体 质粒载体根据用途分类 原核生物表达载体 真核生物表达载体
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克隆载体(T-载体)
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反转录合成cDNA
在冰上加入: 组成 溶液A(随机引物RP) 体积 1ul
溶液B(dNTPs)
溶液D(5*RT buffer) 1-5ug Total RNA 溶液G 1、混匀,42℃,60min;
1ul
4ul 6ul 7ul
溶液E(含逆转录酶、RNA酶抑制剂)1ul
2、95 ℃,5min,终止反应。
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质粒DNA (载体)
质粒载体的选择
载体:用于携带重组DNA,并且能够使外源DNA一起复制与表 达的运载工具。基因工程中用得最多的是plasmid载体。
质粒:独立于宿主细胞(如细菌)染色体之外的可进行复制
和遗传的遗传单位-双链闭合环状超螺旋DNA分子。是一种环 状的双链DNA分子,大小从1K-200Kb。分子生物学实验中所 用载体为人工合成的。
自己构建(低成 本,可靠)
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重组质粒构建的基本过程
选择载体 获得目的基因
目的基因与载体的重组
重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定
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重组质粒构建的简单流程
基因组DNA,PCR产物, cDNA (插入子) 限制性酶切 (修饰 DNA 末端) 连接载体与插入片段 转化 (将重组质粒导入宿主细胞) 鉴定重组子
条件 识别序列
ATP, Mg2+ EcoK: AACN6GTGC EcoB: TGAN8TGCT 离识别位点至少 1000bp
Mg2+ 回文结构
ATP, Mg2+ EcoP1: AGACC EcoP15: CAGCAG 离识别位点24-26 bp
切割位点
靠近或与识别位点 一致
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限制性酶切的原理
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)
能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的
DNA序列之内或其附近的特异位点上,并切割双
链DNA。
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限制性核酸内切酶的类型和主要特征
I型 功能 内切酶 & 甲基化酶 II 型 内切酶 III 型 内切酶
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PCR扩增
取1支0.2ml的PCR管,在冰上加入: 组成 RT反应产物 溶液F(10*PCR buffer) 溶液B(dNTPS) 溶液H(β-actin 引物) 溶液C(Taq 酶) 体积 8ul 5ul 1ul 1ul 1ul
溶液G
34ul
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PCR反应参数的设臵
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重组载体的转化
感受态细胞 (Competent cells): 经过 CaCl溶液处理的E.
coli 细胞对外源DNA的吸收变得非常敏感,其细胞内的酶限制修饰系统被抑制,有利于外源基因的转化、表达和繁殖,这种 细胞被称作感受态细胞. 转化 (Transformation): 感受态细胞吸收外源DNA的过程. 热激 (Heat-shock): 将 DNA 与宿主细胞混合后,将宿主
T4DNA连接酶可连接DNA- DNA,DNA-RNA,RNA-RNA和
双链DNA粘性末端或平头末端。
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影响连接效率的因素
A ATP 浓度 B 连接酶浓度
C 反应时间
D insert和vector的比值(载体DNA和外源DNA的分子数
比(浓度比)为1:3~1:10)
E 连接温度 其中连接温度是影响连接效率的最重要的因素。
RT-PCR 实验原理
RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚 合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反
转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为
模板,扩增合成目的片段。
RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两
步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。
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识别序列
识别 4-8 bp 的回文序列. 常用的酶识别 6 bp 发生的概率为 46=4096 bp/每次. (44=256 bp; 48=65536 bp)
如 EcoRI 识别序列:
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
限制性内切酶的特点 1. 高度特异性 2. 商业化生产 3. 反应需要Mg2+ 4. 不同的内切酶可能产生相同的末端
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人工构建质粒的基本元件
启始复制子:使质粒在宿主细胞中能够复制 抗性基因:用于筛选阳性克隆。 多克隆位点:插入外源基因。 对于表达载体还需要启动子、多聚A尾等。 易于操作:包括宿主、转化(或转染)、分离纯化、 重组等等。
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pBR322 plasmid 是一个克隆
在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染:使用
抗气雾剂移液管阻止气雾剂进入 eppendorf 管内;为PCR样 品配制和扩增后分析设计隔离的区域,在准备新反应前更 换手套;总是使用不含有模板的阴性对照检测污染;使用 预先混合的反应成分,而不是每个反应的每个试剂单独加
入。
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操作步骤
1、RNA的提取; 2、反转录合成cDNA;
3、PCR扩增;
4、产物的电泳和结果的测定。
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RNA的提取
RT-PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要,包括RNA 的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少 RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定,分布广泛,除 细胞内源性RNA酶外,环境中也存在大量RNA酶。因此 在提取RNA时,应尽量创造一个无RNA酶的环境,包括 去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性,主要 是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶,通过 RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫 氰酸胍抑制内源性RNA酶。
T-Vector是一种高效克隆PCR产物 (TA Cloning) 的专用载体, 由pUC18载体改建而成的。在pUC18载体的多克隆位点处的Xba I 和Sal I 识别位点之间插入了EcoR V 识别位点,用EcoR V 进行酶 切反应后,再在两侧的3 ’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA 聚合酶反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性,所以
非转化子:为接纳Biblioteka Baidu体或重组分子的非转化细胞。
重组子:含有重组DNA分子的转化子。 非重组子:仅含有空载载体分子的转化子。
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转化子的筛选与重组子的鉴定方法
基于载体遗传标记的筛选与鉴定
利用载体DNA分子上所携带的选择性遗传标记基因筛选转化子或重组 子
基于克隆片段序列的筛选与鉴定
目的基因与载体的重组(酶切与连接)
核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键, 从而导致核酸分子多核核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶。 核酸酶可分为两类:核酸外切酶(exonuclease)是从核酸 的一端开始,一个接一个把核苷酸水解下来; 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’,5’磷酸 二酯键,将核酸链切断。
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本课程主要内容
核酸实验: 重组质粒的构建与表达 蛋白质实验:
原核质粒
真核质粒 GST pull-down
蛋白质相互作用研究的常用方法 免疫共沉淀
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实验一
重组质粒的构建
1,分子生物学最基本、最重要的实验技术 公司合成服务 2,目前重组质粒的获取方法 同行馈赠
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