分子生物学实验技术实验内容
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验技术.pptx
DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环 境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、 有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环 境又可以使DNA复性。
SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞 裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌 细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒 DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放 出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。 然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中 性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分 子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中， 而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底 部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出 来。
2. 启始复制子（ori, Origin of
replication)； 3. 多克隆位点(MSC, Multiple cloning
site or polylinker)； 4. 标பைடு நூலகம்基因(Marker gene, such as
LacZ gene)。
Ampr抗性基因
Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地 切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力
分子生物学实验
目录
实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取 实验三、琼脂糖凝胶电泳 实验四、ＤＮＡ的限制性酶切 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA
的转化 实验六、PCR基因扩增技术
实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定
一、实验目的
• 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提 取方法
P(BLA) ApaLI (2367)
APr
pUC19
2686 bp
分子生物学实验技术3篇
分子生物学实验技术
第一篇：PCR技术
PCR（聚合酶链反应）是一种基于体外体内 DNA 复制的技术。
PCR 技术广泛应用于分子生物学、生物医学研究、医学诊断、生物技术等领域。
在 PCR 中，核酸模板、引物、聚合酶和反应缓冲液是必不可少的组成部分。
PCR 引物是在特定位置的 DNA 片段，用于诱导聚合酶模板 DNA 的扩增。
聚合酶通过催化模板 DNA 在 DNA 引物的引导下合成相应的 DNA 片段，产生大量的重复 DNA 片段。
PCR 是一种快速、高效、灵敏的 DNA 分析技术，可以对非常小的样本进行扩增。
PCR 的操作流程如下：
1．取得合适的 DNA 样品。
2．准备 PCR 反应体系，包括 PCR 反应缓冲液、聚合酶、DNA 模板和引物。
3．用 PCR 机进行程序设定和反应。
4．检查 PCR 反应产物，包括 PCR 产物的带型和验证PCR 产物的特异性和纯度等。
PCR 的应用
1．DNA 序列鉴定以及 DNA 序列变异检测。
2．基因表达分析、基因定量、等位基因分析等基因功能研究操作。
3．分子诊断，可以根据染色体、基因、蛋白质等材料进行分析。
4．农业和畜牧业生物工程的研究。
优点：
PCR 反应时间逐渐缩短，灵敏度高，重现性好，稳定性强。
PCR 技术可以在非常小范围内进行 DNA 分析，并可以处理复杂的实验体系。
缺点：
PCR 技术还有一些局限性，比如需要合理设计引物，需要准确的温度控制，需要恰当的试剂，且对样品的纯度和净化度有严格的要求。
研究生生物学教案：细胞分子生物学技术实验
研究生生物学教案：细胞分子生物学技术实验一、引言本教案旨在介绍研究生生物学课程中的细胞分子生物学技术实验内容。
通过这些实验，研究生将能够深入了解和掌握细胞分子生物学领域的基本操作和技巧，培养科研素质和实验技能。
二、实验目标1.掌握DNA分离与纯化技术。
2.理解PCR（聚合酶链式反应）原理及其应用。
3.学习基因克隆的方法和原理。
4.熟悉蛋白质表达与纯化技术。
5.实践基因组编辑技术CRISPR-Cas9。
三、实验内容3.1 DNA分离与纯化•实验原理：该实验旨在通过裂解细胞获得DNA，并利用离心等方法进行DNA的纯化。
•实验步骤：•组织样品处理；•细胞裂解；•蛋白质沉淀；•DNA沉淀与洗涤；•最后的DNA溶解。
3.2 PCR技术•实验原理：PCR是一种重复性进行的体外DNA复制方法。
该实验旨在利用PCR技术扩增目标DNA段。
•实验步骤：•DNA模板的准备；•寡核苷酸引物设计；•PCR反应体系配制；•PCR程序设置；•PCR产物分析。
3.3 基因克隆•实验原理：基因克隆是将感兴趣的DNA序列插入载体，并转化到宿主细胞中，使其能够稳定地表达目标蛋白质。
•实验步骤：•DNA片段切割与连接；•载体的选择与准备；•受体菌株的选择与转化；•克隆子筛选与验证。
3.4 蛋白质表达与纯化•实验原理：该实验旨在通过大肠杆菌表达系统表达目标蛋白质，并利用亲和层析等纯化技术纯化蛋白质。
•实验步骤：•表达载体构建与转化；•菌液培养与感诱液处理；•细胞裂解与终浓缩液处理；•蛋白质纯化与分析。
3.5 CRISPR-Cas9基因组编辑•实验原理：CRISPR-Cas9是一项革命性的基因组编辑技术，本实验旨在进行CRISPR-Cas9介导的基因敲除实验。
•实验步骤：•核酸序列设计与构建；•整合载体注射或转染；•细胞培养与筛选；•效果验证。
四、实验评估每个实验的评估将基于学生的实际操作能力、理解程度和结果展示情况，并根据提交的报告和数据进行评分。
分子生物学实验3篇
分子生物学实验第一篇：PCR技术在分子生物学中的应用PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学中一项广泛应用的技术，被用于DNA的扩增和检测。
PCR技术已经成为了分子生物学和生物医学研究的基础技术之一。
PCR技术被广泛的应用于遗传学、人类学、医学研究、植物学和动物学研究等各领域。
PCR技术的基本原理是：通过提取DNA，将DNA特异性引物与模板DNA相结合，利用热稳定DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸为反应体系提供能量，使其在一定条件下循环扩增目标DNA片段。
通过PCR扩增后的DNA片段可以进行进一步的分析和检测。
PCR技术的扩增具有明显的优势，可同时扩增不同长度的DNA片段，扩增时间短，扩增的精度和重复性高，且所需的样本量小。
PCR技术在分子诊断、基因组学和分子系统学等领域的应用不断扩展和深化。
随着PCR技术的不断发展，PCR在分子生物学研究中的应用越来越广泛，成为分子生物学研究的重要工具。
第二篇：RNA干扰技术在分子生物学中的应用RNA干扰（RNAi）是分子生物学中一种重要的现象，其中小分子RNA片段通过RNAi途径参与靶基因的沉默和调节。
RNAi技术是人类基因功能研究中最具前途的一种技术之一。
RNA干扰技术的基本原理是通过利用RNAi分子的特异性配对功能，引导RNAi分子与靶基因mRNA相结合，导致mRNA的降解和翻译的抑制，实现对基因表达的调控。
RNA干扰技术在分子生物学研究中有广泛的应用，如：功能基因的筛选、基因表达调节、基因功能验证等。
RNA干扰技术具有多种优点，如高效性、特异性强、节约时间、资源和成本等方面的优势，逐步成为生命科学研究中的重要工具。
在研究过程中，RNA干扰技术常用于寻找分子病理学中新的治疗靶点，鉴定靶点基因和靶点蛋白，为新药物的开发和临床治疗提供了重要的理论和实验基础。
第三篇：基因克隆技术在分子生物学中的应用基因克隆技术始于20世纪70年代，是指将DNA分子导入到载体中，使其在细胞中进行表达的过程。
分子生物学实验室常见实验
分子生物学实验室常见实验
1.基因克隆：通过PCR扩增目标基因或外源基因，将其克隆到载体中，如质粒、病毒等，使其能够在宿主细胞中表达。
2. PCR：聚合酶链式反应，是一种可在体外扩增DNA序列的技术，适用于从少量DNA样品中扩增特定区域的DNA片段。
3. 蛋白质表达与纯化：通过基因克隆，将目标蛋白质表达于宿主细胞中，并通过蛋白质纯化技术将其纯化出来。
4. DNA测序：通过测序仪对DNA序列进行测定，可以用于基因组测序、基因突变分析等。
5. RNA干扰：通过RNA干扰技术，将RNA分子导入到细胞中，靶向特定的基因，从而抑制基因表达。
6. 细胞培养：将细胞放入培养皿中，提供合适的营养物，使其在体外生长并繁殖，可用于体外实验研究。
以上是分子生物学实验室常见实验，这些实验技术广泛应用于生命科学领域的基础研究和应用研究，为疾病诊断和治疗等方面提供了重要的科学支持。
- 1 -。
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
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2006 年《分子生物学实验技术》实验内容RT-PCR（一）总 RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：TM（苯冰预冷的900μlLS -Biotragents液体样品加入 1.5ml Ep管中，再加入1、将100μ l 酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl 氯仿，颠倒Ep 管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g 离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep 管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min 后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA 沉淀和管壁。
8、将RNA 沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl 无RNase污染的水（RNase- FreeWater）将RNA 溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr 或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC 水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr 以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC 处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm 滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
二）反转录实验安排：每人做一管反应体系（20μ l）：按下列顺序加样μl4 5× Bufferμl6dNTPsμl1RNA 酶抑制剂μl1Oligo （dT）μ随机引μ反转录AMV1μ提取RNA6总体μ201h42反应条件：℃注意事项：反应体系中，应先1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR 、引物，最后加酶和模板。
dNTPsBuffer 加水、、2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
℃，以防酶失活。
4、酶类试剂应放置在冰盒上取用，用完后立即放回-20PCR（三）实验安排：每人做一管。
：按下列顺序加样μ l）反应体系（50ddHO 32.7 μl 2510×PCR Buffer μl4μldNTPs2P1 μl2μlP20.3Taqμl4cDNA template μlμl50Total反应程序：预变性94℃2min30s 变性94℃45s 退火50℃1min 延伸72℃30 cycles10min ℃ 72 终延伸PCR产物的检测：琼脂糖凝胶电泳TBE(10×)的配制：1、电泳缓冲液，定溶至1000ml。
，并加入称取Tris-base 54g，硼酸27.5g0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 、1.5% 琼脂糖凝胶的配制：2加100ml，×琼脂糖于三角瓶中，加入10ml 10TBE 缓冲液，并加水定容至称取 1.5g，摇匀后倒入插有梳子的电泳槽，待其凝固后拔去梳子EB(10mg/ml) 热溶解后加入5μ l 即可用于电泳。
3、电泳检测：混合，加入到琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样μ l 产物5μl 与Loading Buffer 1 取PCR 电流进行电泳，约100V DL2000 DNA Marker 作对照，以电压，50mA 品孔旁加入 5 μ l 15min 后于紫外灯下观察结果。
注意事项：、EB有致癌性，电泳操作需戴手套进行。
1 的试污染的手套随意拿其它无EB、禁止将盛有2EB 的器皿随意乱放，且不要戴有EB 剂或仪器。
产物的纯化(四) PCR实验安排：Gel 产物合并后作为一管，用PCR 产物回收试剂盒( E.Z.N.A. 每两人的PCR DNA 。
)回收目的Extraction Kit操作步骤：琼脂糖凝胶电泳后，切下凝胶中含目的条带的胶粒，放入预先称好、1PCR产物经 1.5% 管中。
1.5ml Ep重量的空管放在电子天平上再次称重，计算胶粒的重量。
Ep、将装有胶粒的2．3、按1g胶加1ml的量加入Binding Buffer ，置于55℃－65℃水浴中约7min，其间要摇动Ep 管2－3 次，使胶粒完全溶解。
4、将上述溶胶液加入到HiBind spin -column 中，10000× g 离心1min ，弃去收集管中的液体。
5、加入300μl Binding Buffer ，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。
6、加入750μl SPW Buffer，静置2min，10000×g 离心1min，弃去收集管中的液体。
7、重复步骤6。
8、空管10000×g 离心1min，以弃去DNA 回收柱中的残余液体。
9、将DNA 回收柱放入新的 1.5ml Ep 管中，并加入30μ l DNA Elution Buffer 至膜的中央，10000×g离心1min，以收集纯化的DNA ，经琼脂糖凝胶电泳检测后于－20℃保存。
注意事项：1、电泳时应换用新配制的TBE buffer，否则会由于电泳缓冲液pH 升高而降低DNA 的产量。
2、在切下含目的DNA 的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜(如一次性手套) ，使用无DNA 污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA 的污染。
3、切胶过程要尽可能短，防止DNA 在紫外线下长时间暴露引起突变，且要把含有目的DNA 的胶块尽可能小的切下，以利于后续步骤的进行。
4、DNA 的洗脱效率与Elution Buffer 的pH 有关，因此用ddHO 洗脱DNA 时，应调节2ddHO 的pH 值至8.0。
2二、基因的克隆（一） DNA片断与载体的连接本实验做PCR 回收产物与pMD-18T载体的连接，应用TaKaRa公司的试剂盒进行。
TA克隆原理：利用Taq酶能够在PCR产物的3'末端加上一个非模板依赖的A，而T 载体是一种带有3'T 突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中，主要用于PCR 产物的克隆和测序。
实验安排：每两人做一管。
反应体系（10μ l）：Ligation Solution I 5μlPCR 回收产物 4.5μlpMD -18T vector 0.5μlμl 10 总体积以上16℃ 4h 反应条件：（二）感受态细胞的制备实验安排：每人做一管。
试剂配制：：液体培养基（Luria-Bertani）、1LB 去800mlNaCl 10g，溶于称取蛋白胨（Tryptone） 10g，酵母提取物（Yeast extract） 5g，分钟。
高压下蒸气灭菌20 加去离子水至总体积1升,NaOH离子水中，用调pH 至7.5,溶液：、0.1mol/L CaCl22m0.22μ定容至100ml，高压灭菌或称取 1.11g CaCl （无水，分析纯），溶于超纯水中， 2 滤膜过滤除菌。
3、无菌甘油：100ml，高压灭菌即可。
取甘油（无菌操作）：操作步骤液体培养基中，2ml LBDH5 α的平板上挑取一个单菌落，接种于1、从生长有大肠杆菌振荡培养过夜，作为一级种子。
℃200r/min37 振荡培养200r/min℃ 50 比例无菌转接到5ml LB 液体培养基中，371: 2、将一级种子按0.5达到左右。
约2h-3h，至细菌的OD600 30min。
3、在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的 1.5ml Ep管中，冰浴，弃上清。
离心4000 r/min10min4、4℃ 。
－30min0.1mol/L CaCl、加入1ml 冰预冷的重悬沉淀，继续冰浴15min52 10min，弃上清。
℃ 4000 r/min 离心6、4 悬浮的感受态细胞可直接用轻轻重悬。
用冰预冷的0.1mol/L CaCl2007、沉淀中加入μ l2℃保存管，-70/10015%于转化，若要保存，则需加入无菌甘油至终浓度为，分装μ l 备用。
注意事项：1、细胞生长状态：不要用经过多次转接或储存于4℃的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中取适量在LB 固体培养基上划线培养，作为制备感受态细胞的菌种。
2、细胞生长密度：以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 来控制。
6007OD 菌株的DH5 α个/ml 左右（不同菌株情况有所不同，细胞密度在5×10）为0.5600 时比较合适。
密度过高或不足均会影响感受态细胞的转化效率。
3、试剂的质量：所用的试剂，如CaCl 等均需是高纯度的（AR.），并用超纯水配制，最2好于-20℃分装保存。
（三）连接产物的转化实验安排：每人做一份。
试剂配制：1、氨苄青霉素（Ampicillin, Amp）母液：用灭菌的ddHO将氨苄青霉素粉配成100mg/ml 水溶液，经0.22μm滤膜过滤除菌 2 后，置-20℃保存备用。
＋）：、LB 液体培养基（Amp2在LB 液体培养基中加入1μl 100mg/ml的氨苄青霉素母液后混匀即可，一般现配现用。
＋）：固体培养基（LBAmp 3、在LB 液体培养基中加入 1.5%的琼脂粉，15磅高压蒸气灭菌20min。
待培养基温度降至50℃左右，加入1μl 100mg/ml 的氨苄青霉素母液后，铺制平板。
待培养基凝固后，于4℃保存备用。
操作步骤：1、取-70℃冻存的感受态细胞于冰上融化后，加入连接产物5μl ，轻轻混匀，冰浴30min 。
2、42℃水浴热激90sec，再迅速放回冰上2min 。
3、加入400μl LB 液体培养基，37℃ 200r/min-220r/min 振荡培养45min 后，以恢复质粒的抗性。
4、4℃ 4000r/min 离心5min，弃去上清400μl ，将剩余的100μl 菌液混匀后涂氨苄平板，37℃培养30min（平皿正放），待菌液吸收完全，再将平皿倒置培养约12h－16h，至单菌落出现。
注意事项：1、质粒的浓度：转化效率与外源DNA 的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA 的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。
一般情况下，DNA 溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%。
2、在感受态细胞中加入连接产物后应轻轻混匀，避免使细胞破裂。
3、同时应做两个对照，以检验氨苄青霉素的抗性和感受态细胞的质量。
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。
对照组2：以质粒代替DNA 溶液，其它操作同上，此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应出现大量菌落。