分子生物学实验基本技术训练
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学：基础实验技能培训实验操作手册
基础实验技能培训实验操作手册2014-08植物基因组DNA提取实验材料：植物样本，植物基因组DNA提取试剂盒，β-巯基乙醇，氯仿，无水乙醇实验仪器、耗材：移液器、电泳仪、离心机、研钵、研钵棒、剪刀、天平、液氮实验前准备：1．Buffer GP1在使用前请加入β-巯基乙醇，5 ml Buffer GP1加5 μl β-巯基乙醇。
加入β-巯基乙醇的Buffer GP1室温可保存1个月。
2．预热水浴锅65度，将加入配制好的巯基乙醇预热。
3．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer GW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。
4．称取植物样本约100 mg。
5．在研磨植物材料前，向研钵中倒入酒精，放入剪刀、钥匙高温消毒。
6．研钵、剪刀、钥匙冷却后，将液氮加入在研钵中以预冷研钵。
实验步骤：1. 取植物新鲜组织约100 mg，用剪刀将样本剪碎，放入研钵，加入液氮充分研磨至粉末状。
将粉末转移到离心管中。
注意：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。
而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase 有可能降解基因组DNA。
2. 加入700 μl 65℃预热的Buffer GP1（Buffer GP1在使用前请加入β-巯基乙醇，5 ml BufferGP1加5 μl β-巯基乙醇），迅速颠倒混匀后，将离心管置于65℃水浴20分钟，水浴过程中颠倒离心管混匀样品数次。
3. 加入700 μl 氯仿，充分混匀，12,000 rpm（～13,400×g）离心5分钟。
小心将上层水相转入一新的离心管中，加入700 μl Buffer GP2，充分混匀。
4. 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube）的吸附柱（Spin Column DM）中。
若一次不能加完溶液，可分多次转入。
10,000 rpm（～11,500×g）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5. 向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），10,000 rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
实验一、分子生物学基本操作及常用仪器介绍
4、不测量时要打开暗室盖，以确保光门关闭，以 免加快光敏元件的老化（比色计暗室上有一小钉， 压下后光门打开）。
5、灵敏档选择的依据时能够调零，尽量选用低档， 这样可以确保读数较稳定。
6、所测得的A值尽量在0.1～0.7之间，（最好在 0.2～0.6之间），因为此值范围内读数较准，超 过时，应稀释溶液
二、分子生物学实验的特点
1、分子生物学实验主要应用化学原理和方法所设计 的科学实验，也渗进了一些相关学科的理论知识与 方法。
2、由于研究对象为生物体，所以标本的来源不易， 微量和定量是分子生物学实验的一大特点。
3、分子生物学实验往往涉及生物大分子和生物材料 的检测，因此取材常为生物体的组织器官，甚至是 活的生物体。所以很难保证样品、标本的无菌性， 要注意作好自身防护。
4、实验课后均要将用过的仪器试管进行清洗，并整理 台面。
四、基本操作
（一）仪器的清洗
1、一般玻璃仪器：如试管烧杯量筒三角瓶等，先用自 来水洗刷，用毛刷沾少许肥皂粉或去污粉洗刷；再用自 来水反复冲洗，去尽肥皂水或去污粉直至无泡沫，最后 用蒸馏水淋洗2～3次，干燥备用。
2、做定量实验或要求严格时，除了用去污剂外，还需 以热洗液洗涤一次（或冷洗液浸泡过夜），而后再用蒸 馏水淋洗2～3遍。洗液由浓硫酸—重鉻酸钾—水按一定 比例根据不同需要配成。
（二）吸量管的使用与选择
1、吸管为精密吸量器，其规格有：0.1ml、0.25ml、1ml、2ml、 5ml、10ml等，有的吸量管上有两个环，上面的数字标示最 大体积，下面的是最小分刻度体积。根据实验需要，选择合 适规格的吸量管。如吸取1.5ml溶液，以选2 ml为宜；若用1 ml吸两次，则会增大误差。另外还应注意，在一组实验中， 吸量同一种试剂，应尽量选用一支移液管，以减少系统误差。
分子生物学专题训练(含答案)
分子生物学专题训练(含答案)分子生物学是研究生物体内分子结构、组成和功能的学科。
以下是一些分子生物学的专题训练题目及其答案。
1. DNA复制问题：DNA复制是指什么？在细胞中是如何进行的？答案：DNA复制是指在细胞分裂过程中，将一个DNA分子复制成两个完全相同的DNA分子的过程。
在细胞中，DNA复制通过酶的作用，在DNA双链上建立一个新的互补链，生成两个完全相同的DNA分子。
2. 基因转录问题：基因转录是什么过程？主要酶有哪些？简要描述转录的过程。
答案：基因转录是指将DNA中的基因信息转录成mRNA的过程。
主要酶有RNA聚合酶和辅助因子。
转录的过程分为三个阶段：起始、延伸和终止。
起始阶段是RNA聚合酶与DNA结合，形成转录起始复合物；延伸阶段是RNA聚合酶沿DNA模板链合成mRNA链；终止阶段是mRNA链与RNA聚合酶和DNA分离，形成终止转录复合物。
3. 翻译过程问题：翻译是指什么过程？主要的遗传密码是什么？简要描述翻译的过程。
答案：翻译是指将mRNA中的核酸序列转译成蛋白质的过程。
主要的遗传密码是以三个核苷酸为一个密码子，共有64种可能的密码子，编码了20种氨基酸和一个终止信号。
翻译的过程分为起始、延伸和终止三个阶段。
起始阶段是在起始密码子AUG的指导下，启动翻译过程；延伸阶段是tRNA带着相应的氨基酸与mRNA上的密码子互补配对，合成蛋白质链；终止阶段是遇到终止密码子时，翻译终止，释放蛋白质。
4. DNA重组问题：DNA重组是指什么过程？主要的DNA重组方式有哪些？简要描述DNA重组的过程。
答案：DNA重组是指在细胞中不同DNA分子之间交换DNA片段的过程。
主要的DNA重组方式有两个：同源重组和非同源重组。
同源重组是指两个同源染色体或同一个染色体上的两个同源DNA片段之间的重组；非同源重组是指不同染色体或同一染色体上的非同源DNA片段之间的重组。
DNA重组的过程包括DNA切割、DNA片段交换和DNA连接三个步骤。
分子生物学实训报告
一、实训背景分子生物学是研究生物大分子如蛋白质、核酸的结构与功能的一门学科。
随着生命科学技术的不断发展，分子生物学在医学、农业、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。
为了更好地理解和掌握分子生物学的基本理论和技术，我们开展了为期两周的分子生物学实训课程。
本次实训旨在通过实际操作，加深对分子生物学理论知识的理解，提高实验技能，培养科研素养。
二、实训目的1. 熟悉分子生物学实验室的基本操作规程和安全规范。
2. 掌握DNA提取、PCR扩增、酶切、电泳等分子生物学实验技术。
3. 理解基因克隆、基因表达、蛋白质分析等分子生物学实验原理。
4. 提高团队协作和沟通能力，培养科研素养。
三、实训内容1. 实验室基本操作与安全规范（1）熟悉实验室布局，了解各种仪器的使用方法。
（2）学习实验室安全操作规程，掌握实验室废弃物处理方法。
（3）进行实验前的准备工作，如配制试剂、消毒、无菌操作等。
2. DNA提取（1）了解DNA提取的原理和常用方法。
（2）学习酚-氯仿法提取DNA。
（3）对提取的DNA进行质量检测，如A260/A280比值、琼脂糖凝胶电泳等。
3. PCR扩增（1）了解PCR扩增的原理和步骤。
（2）设计PCR引物，进行PCR反应。
（3）对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
4. 酶切（1）了解酶切原理和酶切反应条件。
（2）学习限制性内切酶的用法。
（3）进行酶切反应，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
5. 电泳（1）了解电泳原理和电泳技术。
（2）学习琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等电泳技术。
（3）对DNA、蛋白质等生物大分子进行电泳分离和检测。
6. 基因克隆、基因表达、蛋白质分析（1）了解基因克隆、基因表达、蛋白质分析的基本原理。
（2）学习相关实验技术，如载体构建、重组表达、蛋白纯化等。
（3）对克隆的基因、表达的蛋白进行检测和分析。
四、实训过程1. 实验前准备（1）查阅相关文献，了解实验原理和操作步骤。
（2）配制实验试剂，确保实验用品齐全。
分子生物学与细胞生物学实验基本技术
分子生物学与细胞生物学实验基本技术2005-02实验一组织块培养法一、目的学习原代培养方法，从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
二、概述组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。
可以采用剪切法，即将组织块剪切成小块后，接种于培养瓶，组织小块贴壁24h或更长时间后，细胞就从组织四周游出。
但由于在反复剪切和接种过程中对组织块的损伤，并不是每个小块都能长出细胞。
用于组织块培养的培养瓶可根据不同细胞生长的需要作适当处理，如预先涂以胶原薄层，以利于上皮样细胞等的生长。
（本节以新生牛主动脉平滑肌培养为例）三、材料（一）仪器1.净化工作台2.恒温水浴箱3.冰箱（4℃、-20℃）4.倒臵相差显微镜5.培养箱（二）玻璃器皿1.培养皿（Φ100mm）2.吸管（弯头）3.烧杯（500ml、200ml、10ml）4.广口试剂瓶（500ml）5.玻璃瓶（250ml、100ml）6.培养瓶7.废液缸（三）塑料器皿1.吸头2.枪头3.胶塞4.EP管（四）其他物品1.微量加样枪2.眼科组织剪（直尖、弯）3.眼科组织镊（直、弯）4.12.5cm组织镊（无钩、1×2钩）5.25cm敷料镊（无钩）6.止血钳（18cm直纹式、12.5cm直纹式、弯纹式）7.解剖剪（五）试剂1.D-Hanks液2.小牛血清3.RPMI16404.双抗（青霉素、链霉素）5.1N HCl6.7.4%NaHCO3四、操作步骤1.取材：打开胸腔，无菌操作下取出主动脉胸段，浸到预先配制好的含双抗（500u/ml青、链酶素）的D-Hanks液中漂洗。
2.组织的冲洗、修剪：取出主动脉，用锋利的剪刀修剪除去周围组织，再用D-Hanks冲洗主动脉3次，除去血块及杂组织等。
3.平滑肌组织分离：纵向剖开主动脉，撕下主动脉内层，取主动脉中层的平滑肌组织，无血清RPMI1640漂洗3次。
4.剪切：将平滑肌组织用锋利的眼科剪反复剪切至剪成1mm3小块，在剪切过程中，可以适当向组织中滴加1～2滴培养液，以保持湿润。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学实验一 基础知识和基本技能
安全和纪律教育
实验室安全管理条例 学生实验守则 实验课纪律
基础知识
一、化学试剂的取用
1、固态试剂的取用 2、液态试剂的取用 (1) 量筒量取 (2) 移液枪量取少量或微量的液体 A：移液枪的使用和维护 P27 B：两种移液方法：
前进移液法和反向移液法 P9
移液枪的使用和维护 P27
A管：1.25mL B管：386uL 3、学会使用离心机，将A、B管放入离心机 中，以12000rpm，离心5min。
1、容量设定 2、吸头安装 3、预洗吸头 4、吸液 5、放液 6、卸去吸头 7、调到最大量程，放回原位
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二、常用灭菌方法 P10
1、高压蒸汽灭菌 、高热灭菌 3、灼烧灭菌 4、过滤除菌 5、紫外线灭菌
三、离心机的使用 P31
1、安装与调试 2、操作程序 3、注意事项
基本实验技能培训
1、学会插枪头和装EP管，准备灭菌 2、学会使用移液器，每组各吸两管液体：
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型 号：cheni genins 制造商：SYNGENE
（英国）
未污染
离心技术
（高速冷冻离心机）
➢离心机工作规则：
1、检查离心管是否完好，不要使用有裂缝的离心管。 即使极小的裂缝也会在离心力作用下破裂。
2、每次使用前都要检查转子中是否有别人遗留的离心 管。转子中遗留的离心管可能导致离心机不平衡。
分子生物学实验 基本技术训练
➢PCR技术 ➢电泳技术 ➢离心技术 ➢微量移液技术 ➢无菌操作技术 ➢实验记录与实验报告的书写
PCR技术
（多聚酶链式反应）
PCR是采用分子技术模拟核酸在体内的复 制，实现DNA体外扩增，以获得大量DNA片 段供研究需要。
反应过程：
❖ 94℃ 4min ❖ 94℃ 30S ❖ 50℃ 30S ❖ 72℃ 60S ❖ 72℃ 10min ❖ 4℃ 保存 ❖ End
型 号：MiniSpin 制造商：Eppendorf
（德国）
型 号：3-18K 制造商：SIGMA
（德国）
微量移液技术
➢量液操作注意问题：
（1）不能移取量程以外体积的液体，否则会损坏移液 器。
（2）吸取液体时，先推至第一档在吸取；释放液体时 ，在第一档停顿1-2s后推至终点。
（3）吸取液体时不能太快。如果不小心将液体吸入吸 液杆应报告指导老师，经清洗后方可再用。
30个循环
型 号：PTC-100 制造商：MJ Research
(美国)
电泳技术
（琼脂糖电泳）
分类：
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 醋酸纤维膜电泳 ……
常用
➢琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的异同
聚合方式 电泳方式
毒性 适用对象 操作要求
孔径
琼脂糖凝胶 物理作用 平板 无毒 大分子 简单
与浓度成反比
聚丙烯酰胺凝胶 化学反应 垂直板 神经毒性 小分子 较难
与浓度成反比
➢琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的 最佳分辨范围
琼脂糖浓度 线性DNA的最佳分辨范围（bp）
0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
1，000～30，000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000 50～2,000
❖ 电源：稳压、稳流、稳功率。
❖ 样品制备 （1）适用于琼脂糖电泳的样品可以是基因组DNA、
质粒和PCR产物等大分子。
（2）样品必须与上样缓冲液混合均匀，以保证样品 带电荷。
❖ 琼脂糖凝胶的制备 （1）将铺胶槽调成水平。
（2）准确称取一定质量的琼脂糖放入锥形瓶中， 量取30ml 1×电泳缓冲液倒入锥形瓶，瓶口倒扣 一个小烧杯。
3、将平衡的离心管对位放置，盖好转子盖。如果离心 启动后发现转子盖没盖，应停止离心，盖上转子盖后 再启动。
4、离心完成后应立即从离心机内取走样品。离心结 束后若样品长时间留在离心机里。会沉淀重新分 散开。
5.低温离心机在两次运行之间应关上盖子，以避免冷 凝。
6.每一次使用完离心机后都要将离心机内部清理干净 并填写使用记录。
在DNA双螺旋结构中碱基处于双螺旋结 构的内部，呈平面结构，垂直于螺旋轴成对排 列。糖基—磷酸脂基构成主链暴露在外表面， 并带有磷酸脂基的负电荷。 DNA分子电泳时 的迁移速度与凝胶孔径和所带电荷量成正比， 与分子大小成反比。
➢操作过程
❖操作前的准备
（1）标准分子质量标记（Marker）
Marker是一组固定的分子量的样品混合物，经电泳后 各成分会按照分子量大小进行排列。标准分子质量 标记作为样品的参照标准应与样品同时电泳。如： 1Kb DNA Marker：1000，2000，3000，4000，5000， 6000，7000， 8000，10000。
（4）使用完后，一定要将移液量调至最大量程，以免 压缩弹簧导致弹簧不能回复。
（5）移液器必须卸掉枪头后才能放在移液器架上。
➢各种酶等溶液的移取问题
分子生物学中由于移取试剂体积较小可以 使用微量移液器先将试剂（如引物,缓冲液等） 分别加到管壁上，加完之后通过点动离心,使液 体聚到管底，然后轻弹管底使之充分混匀。
❖注意事项：
（１）制胶槽要调成水平 （２）加样时移液器头不要插破胶孔。 （３）加样的体积不要大于胶孔的体积。 （４）琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 （５）在电泳时，电泳缓冲液应略高于琼脂糖凝胶
面，琼脂糖凝胶点样口应放在电泳槽负极一侧。 （6）不要用手直接接触凝胶及凝胶成像仪内部。
型 号：Power Pac Basic TM 制造厂：BIO-RAD
❖ 样品缓冲液： 盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至 点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。例如 6×Loading Buffer：30%(v/v)甘油，0.25%（w/v) 溴 酚蓝，0.25%（w/v)二甲苯腈蓝，蒸馏水配置。
❖ 电泳缓冲液： 凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致． 琼脂糖凝胶电泳最常用的缓冲液是TAE (Tris-醋酸－ EDTA）与TBE (Tris-硼酸－EDTA）。
分子生物学反应体系中的酶要最后加入到体 系中.
无菌操作技术
➢器材包扎
1、三角瓶至少留1/3空间，先盖透气膜，后盖报 纸，线绳缠好。 培养时不能覆盖报纸，透气膜用完后回收。
2、枪头盒、EP管盒、培养皿要用报纸包好。 3、离心筒将盖旋紧后回旋半圈，报纸包扎。
❖加样和电泳
（１）取一只PE手套，用移液器在上面点上上样 缓冲液，然后取样品使其与上样缓冲液混合均匀 点在胶孔中。
（２）标准分子量标记直接点在胶孔中。
（３）盖好电泳槽盖，正确连好导线。
（4）在电泳时，为了获得电泳分离DNA的最大 分辨率，电场强度不应高于5 示剂距凝胶前沿约1cm是停止电泳。 （２）关闭电源，取出凝胶，放入凝胶成像仪观察。
（3）将锥形放入微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全 部融化透明，摇匀。加热时避免凝胶溶液爆沸。
（4）待凝胶冷却至50～60℃时加入染料，混匀 后匀速倒入胶托中。倒胶时避免温度过低防止 凝胶凝固结块或出现气泡。若凝胶出现气泡则 不允许使用。
（5）小心将梳子插在胶托中，待凝胶完全凝固 后再拔出梳子。
（6）将凝胶放入电泳槽中，并向电泳槽中倒入 1×电泳缓冲液，液面高过胶面2～5mm。