微生物学试验目的与要求

（二）暗视野观察钩端螺旋体（示教）
【材料】
1．菌种：钩端螺旋体培养物
2．盖玻片（0.16毫米以下）、薄载玻片（1.5毫米以下）、暗视野集光器，虹彩 光阑或特制油镜头、强光灯。
【方法】
1． 取下普通光学显微镜上原有的明视野集光器，并使其顶面与载物台相平。
2． 卸下油镜头，添加一虹彩光阑或换以附有缩放光阑的特制油镜头。
5.自然干燥，Giemsa染色（染料1：20稀释，需染3小时以上） 。
6.低倍镜观察，可见菌落染上蓝色，中间深，四周较浅。
五、沙眼衣原体（示教）
材料】沙眼包涵体示教照片。
方法】观察示教照片可见在细胞浆内有散在型、帽型等包涵体，呈蓝色。
六、立克次氏体（示教）
材料】立克次体示教片。 方法】用油镜观察示教片中经
（二）支原体菌落染色（示教）
【材料】 支原体固体培养物，载玻片、滴管、烧杯、三角架、石棉板、小刀、显微镜。
【方法】
1．用低倍镜在平板上固定一个菌落，再用小刀切下带菌落的琼脂块。
2．将菌落的一面连同琼脂覆盖于载玻片上。
3.把载玻片放入80~85C的水中，见琼脂发白，脱落后取出。
4•再用滴管吸取100C左右的水洗载玻片数次至镜检载玻片上无琼脂即可。
（三）螺旋体（示教及操作） 。
（四）肺炎支原体（示教） 。
（五）沙眼衣原体（示教） 。
（六）立克次体（示教） 。
一、 录 像
真菌培养方法、
检查方法、浅部真菌病人指甲、毛发如何检查，白假丝酵母及
新型隐球菌形态特征、培养、病人标本检查。
二、真菌形态、菌落等
（一）菌的基本形态（示教）
【材料】多细胞真菌的棉蓝染色片，白假丝酵母革兰染色片。 【方法】
四、肺炎支原体（示教）
（一）支原体在固体培养基上的特点（示教）
【材料】肺炎支原体平板培养物或菌落照片。
【方法】
1．取培养物平板， 倒置于带人工光源的显微镜台上， 用低倍镜（10~40倍左右）
观察菌落或观察照片。
2．菌落直径约在10~600微米之间，呈明显“油煎蛋”样菌落，包括一个不透 明，颗粒状的中央区并垂直长入琼脂中，而在培养基表面有一扁平，透明的边缘区。
三、螺旋体
（一）螺旋体形态及染色（示教） 【材料】梅毒螺旋体示教片，钩端螺旋体示教片。
【方法】
1．梅毒螺旋体示教片用Fontana镀银染色。梅毒螺旋体非常细小，螺旋体呈棕 褐色，仔细观察可见到有紧密的螺旋8~14个。
2．钩端螺旋体示教片系钩端螺旋体纯培养涂片。 用于Fontana镀银染色法染色， 镜下可见棕褐色的两端有钩，类似S型的螺旋体，螺旋不太清楚。菌体整齐、细粗 均匀。
6．置无菌培养皿内，载玻片用玻璃管架起。皿内稍盛清水，以维持湿度。
7．置室温培养，数日后即可逐日观察其生长发育情况。
（四）浅部真菌病临床检查（操作）
【材料】病发或足癣患者的皮屑，10〜20%KOH溶液，小镊子、载玻片及盖玻
片。
【方法】
1．标本的采集：采集发癣标本时，用镊子选拔病损部位的断残头发或带白色菌 鞘的毛发，损害处断发或边缘的脱屑最易获得阳性结果。黄癣痂亦易得阳性结果。 如采取足癣标本时则用小刀刮取损害边缘部皮屑；若是趾间有损害，选择潮湿或干 裂皮屑。用过的镊子或小刀立即经火焰灭菌。
附录：
1.改良沙堡琼脂培养基制法： 成分：蛋白胨10克
琼脂15克
葡萄糖40克
蒸馏水1,000毫升
制法：
1将上述葡萄糖、蛋白胨及琼脂，放入蒸馏水1,000毫升，煮沸，待琼脂溶解，
【方法】
1．取回形针用镊子弯成圈形或方形，其外周不超出盖玻片之边缘，直径约为
19毫米，回形针圈通过火焰灭菌。
2．取盖玻片（22平方毫米），火焰灭菌，用熔化的石蜡将回形针圈粘着于盖玻 片上。
3．用无菌吸管滴一滴熔化的沙堡氏培养基于回形针圈内。
4．用接种针取菌种少许，接种于培养基上。
5．翻转盖玻片，置经火焰灭菌的载玻片上，用石蜡封固，但下边的开口不封， 使其有充分空气通入。
1．单细胞真菌形态示教片油镜检查。 白假丝酵母：卵圆形，革兰氏染色阳性，可见假菌丝。
2．多细胞真菌形态示教片，低倍或高倍镜观察。 注意观察不同形态的大分生孢子、小分生孢子及菌丝。
（二）真菌的菌落（示教）
【材料】ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
白假丝酵母斜面培养物一支、多细胞真菌斜面培养物2－3支。
【方法】
观察菌落的形态、性质、色素等特点。
2．标本的处理：将病发或皮屑放于玻片上，滴1〜2滴10~20％KOH溶液，加
以盖玻片，在火焰上稍加热往返数次，放置1 0分钟用手轻按一下盖玻片，若能使之 压平即可镜检（时间过长或加入KOH溶液过浓，都可致使毛发被破坏） 。
3．镜检：将处理完毕的标本，先在低倍显微镜下观察到检查物后，换用高倍镜 观察。观察有无菌丝、孢子及菌丝孢子的特点。
3． 取2－3环菌液，放于薄载玻片上，加上盖玻片。
4． 在暗视野集光器上加香柏油一滴，然后将次台略下移。
5． 置标本片于载物台上，上升集光器，使其表面的镜油与载玻片相接触，勿 使发生气泡。
6． 转动反光镜，使光线集中于暗视野集光器上，用低倍镜观察。当视野中有 一圆形光环出现时，转动集光器上的调节器，将光环移置于视野中心。
7． 另加香柏油一滴于盖玻片上，以油镜检查。
（三）口腔螺旋体墨汁涂片检查法（操作） 【材料】墨汁、牙签、载玻片。
【方法】
1.取玻片一张，用接种环取2~3环墨汁，置于玻片的一端。
2.用牙签从齿龈部取牙垢少许，与墨汁混匀作一推片。
3.干后，油镜检查，片中整个视野呈黑色，各种形态的细菌和螺旋体不被染 色，呈透明、不染色的菌体。
白假丝酵母菌落为类酵母菌落，菌落为圆形，较大，白色，菌落底层有假菌丝 培养基内。
多细胞真菌菌落为丝状菌落，观察不同多细胞真菌的气中菌丝，菌落表面的隆 起和浅沟以及菌落基底背面的颜色。
（三）真菌的小培养法（示教）
【材料】回形针、沙堡氏培养基、石蜡、无菌滴管、载玻片、接种针、多细胞 或单细胞真菌斜面培养物。
实验九 其他微生物
目的
（一）掌握病原性真菌的基本形态、培养特性（单细胞、多细胞） ，浅部真菌临 床标本检查原则。
（二）熟悉钩端螺旋体的形态和染色。
（三）了解沙眼衣原体、肺炎支原体、立克次体的形态及肺炎支原体培养的菌 落特征。
内容
（一）录像：真菌
（二）真菌形态、菌落、浅部真菌病临床标本检查、真菌小培养法（示教与操 作）。