2.食用菌接种室无菌操作及管理细则
食用菌实验-母种原种扩大培养
实验五母种、原种接种扩大培养（板书用）一、实验目的熟悉母种、原种接种操作技能。
二、实验材料和用具接种箱或超净工作台，恒温培养箱，接种钩（针），酒精灯，镊子、、火柴，记号笔，记录本，75％酒精及棉球、95％酒精，母种试管斜面，灭菌好的原种培养基。
三、实验步骤与方法1.无菌测定灭菌后的培养基，随机抽出数支斜面试管培养基，置25—28℃的温箱中培养3天，培养基表面仍光滑，无杂菌出现，证明灭菌彻底，即可供接种使用。
2.接种操作过程无菌操作要点：①无菌箱在启用前先灭菌，将待接种的斜面试管、酒精灯、火柴、接种针等放入箱内，紫外线照射半小时以上。
超净工作台则要先灭菌20分钟。
②双手洗净。
打开工作灯，将双手伸入接种箱内，点燃酒精灯。
用75%酒精的棉球擦拭双手，擦拭方向由前向后。
③左手平托两支试管，拇指按住试管底部，外侧一支是供接种用的菌种试管，内侧一支是待转接母种的斜面试管，两支试管的斜面都应朝上。
右手持接种钩，将接种钩的顶端烧红，并将整条接种柄在火焰上过几次灭菌。
④将两支试管的管口部分靠近火焰，用右手同时夹住两个棉塞。
拔掉两支试管的棉塞，并立即以火焰灼烧管口，并适当转动。
操作过程在不离酒精灯火焰一寸远处进行。
⑤用冷却的接种钩，在长满菌丝的斜面挖取少许菌丝及培养基，然后轻轻抽出试管。
迅速伸进待接试管中，将种块置于培养基的中部，盖好塞子。
接种过程中，应注意保持试管与桌面平行，不要远离酒精的火焰，周而复始。
一支母种可扩接20—25支试管。
贴上标签（或用记号笔），注明菌种或菌株名称及日期。
⑥原种接种：3．菌种培养接好种的试管和原种，放在25℃条件下培养，每隔2-3天检查一次。
遇有杂菌的试管要及时选出，以免污染其他试管。
7～10天后菌丝就可长满试管。
原种30天左右长满。
作业：归纳原种和试管种的接种全过程。
实验五母种接种扩大培养一、实验目的通过对接种箱常规消毒、斜面试管培养基母种(即一级种)接种和培养，基本熟悉母种接种操作技能。
食用菌无菌操作流程
食用菌无菌操作流程食用菌无菌操作是指在无菌条件下进行的一系列操作步骤。
Sterile operation of edible fungi refers to a series of operations conducted under sterile conditions.首先要准备好无菌操作所需的器皿和工具。
First, prepare the utensils and tools needed for sterile operation.在操作前，要洗手并穿戴好无菌衣物和手套。
Before operation, wash hands and wear sterile clothing and gloves.将操作台面用75%的酒精擦拭消毒。
Wipe the operating table with 75% alcohol for disinfection.将工具和器皿放入高压蒸汽灭菌锅中高压蒸汽灭菌。
Place the tools and utensils in a high-pressure steam sterilizer for high-pressure steam sterilization.待工具和器皿冷却后，将其取出放在无菌操作台上。
After the tools and utensils are cooled, remove them and place them on the sterile operating table.将需要使用的菌种培养基半固体化后装入培养皿中。
After semi-solidifying the culture medium, fill it into the petri dishes for use.将菌种转移到无菌操作台上。
Transfer the strains to the sterile operating table.打开紫外线灯，让其照射操作区域15-30分钟。
无菌室操作程序及要求
无菌室操作程序及要求
1、接种检样前要做以下准备工作：
将台面、地面消毒（7 5%酒精），再清洁。
将所有要用的灭菌玻璃器皿、灭菌培养基等摆放好。
要备好酒精灯、酒精棉球（75%、95%）等。
准备完毕打开紫外线灯，消毒30分钟。
2、带检样进入无菌室，换鞋、更衣、戴帽。
进入后不可随便进出。
手用75%酒精消毒后再进行样品的称量、均质、操作等操作。
接种时要用吸耳球吸样，不可用口直接吸。
若无均质器则用灭菌剪刀（擦拭95%酒精后通过灼烧消毒）最大可能的将样品剪碎。
做样时在旁边要放有一条沾有消毒水的毛巾，当样液不当心溅出时可以即时擦拭。
做样时要把标识清楚：测样的编号、稀释倍数，以免发生化验室事故。
工作完毕后对台面、地面进行消毒（7 5%酒精消毒），再清洁。
打扫完毕后打开紫外线灯灭菌30分钟。
接种室操作管理规则
接种室操作管理规则1接种室消毒；接种室在放入经过灭完菌的瓶袋后，先要用消毒液室内空间喷洒消毒，然后打开紫外线灯再用气雾消毒剂双向消毒，服装鞋帽也要放在缓冲间同时消毒。
消毒液要经常更换，不要长时间使用同一种消毒液，消毒时间需要40分钟至1小时。
2接种箱消毒；接种室消毒完毕后，接种工作人员要同时进入缓冲间，不要隔一会进一个，工作人员进入后不得随意外出。
工作人员穿好服装鞋帽，戴上手套口罩，长发的一定要在头上盘好，不要露在帽子外面，然后打开接种箱把待接种的瓶袋、接种用具同时放入接种箱中，接种箱密封后操作人员从接种箱袖口伸进双手把气雾消毒剂点燃，或用紫外线灯光消毒40分钟以上。
3接种操作；接种箱消毒完毕后工作人员用75%酒精擦拭双手和需要用的菌种瓶、管的外壁进行消毒，然后把菌种瓶、管从接种箱的袖口放入接种箱，再次用75%的酒精擦拭双手及菌种瓶、管。
点燃酒精灯灼烧接种用具，再拿掉菌种瓶、管的棉塞，用火焰灼烧菌种瓶管的口部，待接种用具冷却后伸入菌种瓶、管中，轻轻刮下上部的老菌种块和部分菌种扔掉，再次灼烧接种工具冷却后放入菌种瓶、管中待用。
打开待接种的瓶袋，拔掉棉塞后瓶子也要在火焰上灼烧消毒，然后用接种工具取出一些菌种在火焰的上方快速的放到待接的瓶袋中，接完种后把棉塞放在火焰上灼烧后重新塞好，再次重新灼烧接种工具放入菌种瓶中，以待下次使用，这样一次接种程序工作完成。
需要注意的是，接种操作一定要在火焰的上方的2----5公分内，不得超出规定范围。
接种期间接种工具不得碰到瓶、管外壁和任何地方，如不小心碰到需要认真用酒精擦拭接种工具后用火焰灼烧。
4 卫生管理；接种完毕后把接完种的瓶袋摆放在培养室中培养，接种箱和接种室的废弃物都要清理干净，接种箱的底部、顶部和四周要用。
接种室操作管理规则
接种室操作管理规则
接种室是指在无菌的环境下进行植物材料转接、培养物转移、试管苗继代的房间。
接种环节要求：
1.非工作人员禁止进入接种室。
2.接种工作人员进入接种室工作前，需用肥皂将手仔细清
洗干净，并及时剪除指甲，进入接种室必须更换鞋子和
工作服。
3.接种室每天使用前，提前打开紫外灯和臭氧消毒机进行
消毒灭菌半小时，接种操作员进入前提前半小时关闭紫
外灯和臭氧消毒机并打开室内日光灯，待臭氧气味散尽
后方可进入。
4.超净工作台风机和紫外灯使用前需提前半小时打开才能
使用，接种操作工作员坐好位置后需用75%的酒精擦拭
双手和超净工作台面以及内部四壁。
5.接种操作工作人员在接种室内禁止随意进出走动、聊天
喧哗、玩手机。
6.接种室每天使用后，必须及时清理接种过程中产生的垃
圾和废弃物，地面清扫后用消毒液拖地，扫把、拖把等
清洁工具必须接种室专用，使用后及时清洗干净并用消
毒液消毒。
7.定期用消毒液擦拭超净工作台外部四壁、接种小推车等
设备，接种室的空间需定期用臭氧消毒机消毒1～2小时。
食用菌接种室如何消毒灭菌
食用菌接种室如何消毒灭菌食用菌接种室如何消毒灭菌食用菌的接种室需要消毒灭菌才能更好地保证食用菌的成长环境。
以下是小编给大家介绍的食用菌接种室的消毒灭菌的方法，一起来看看吧。
食用菌接种室的消毒灭菌：超净工作台无菌操作规程(1)保持清洁超净工作台应放在干燥清洁的房间内,经常保持清洁。
每次使用前将接种材料和接种工具有序地放在工作台上,并检查是否齐全,然后进行紫外线照射30分,杀菌消毒。
(2)净化操作接种前先开动机器,以净化操区的空区空气气环境,待机器正常运转20分,操作区空气净化后,再进行接种。
(3)规范操作接种人员穿无菌工作服和鞋,戴好口罩和帽子,接种用具放在台面两侧,操作人员的手置于接种材料的下风侧。
工作时严禁搔头,接种时力求敏捷,尽量减少污染的机会,用过的火柴杆、棉球和掏出的老菌皮放入容器内,不得乱放。
(4)接种接种完毕,将已接种的试管或瓶(袋)贴好后处理标签,放进培养室(箱)进行培养,用杀菌药液擦净台面及地面。
(5)甲醛定期熏蒸该管理程序同接种室、(箱)处理。
食用菌接种室的消毒灭菌：接种室(箱)无菌操作规程(1)保持清洁经常打扫卫生,保持接种室(箱)内外清洁。
(2)严格消毒使用前将试管或料瓶(袋)和接种工具有序地放在室(箱)内和工作台上,并检查是否齐全,衣帽和口罩挂在缓冲室衣帽钩上,然后进行紫外线照射或药物熏蒸消毒。
1小时后,操作人员进入缓冲室,用肥皂水洗手后进行更衣、换鞋,戴上口罩、帽子,进接种室或把手伸进接种箱后再用消毒大王喷雾降尘除菌,准备接种。
(3)规范操作工作人员接种前用75%的酒精棉球擦手、擦接种工具和瓶袋,防止交叉感染。
接种时用酒精灯灼烧接种工具,棉塞、试管口、瓶(袋)口不离开火焰区,如棉塞不慎着火,用湿布盖住让其缺氧熄灭。
接种时动作要敏捷,配合要默契,工作时严禁搔头和其他人在室内快步走动,以降低发尘量。
用毕的火柴杆、棉球及掏出的老菌皮应放入容器内,不得乱放。
(4)接种后处理接种完毕,将已接种的试管或瓶(袋)贴好标签,放进培养室(箱),进行培养,将废弃物拿出室(箱)外焚烧或埋掉,将室(箱)内打扫干净。
闲谈食用菌生产中的无菌操作
闲谈食用菌生产中的无菌操作食用菌无菌操作记得20多年前刚上班时，一个干食用菌工作已经多年的老师傅向我们小青年展示扩繁母种技术，在扩繁过程中，我注意到这位老师烧完接种针后，不住的将针往手背上飞快地点一下、点一下，我当时很奇怪，这位老师回答，这是在试一下接种针是否已经冷却，否则直接转扩母种，可能会导致菌种烫死。
我当时怀疑，咱们手上都有杂菌，这样做不就又把接种针污染了，老师傅回答说，没有事，手已经用酒精消毒了，不会有杂菌的。
现在这个做法对错与否，相信很多朋友一目了然，酒精消毒，只是相对杀灭部分杂菌，但是做到完全无菌是不可能的，所以母种出现大量的杂菌感染也就可以理解了。
还有一个搞微生物的好朋友，转扩母种时，总有杂菌污染，无奈之下有求于我，我详细观察了他的接种细节，发现他在烧完接种钩后，为了冷却彻底，习惯性的用酒精棉球擦拭一下，就是这个环节导致接种失败。
以上两例失败的原因在于对无菌操作的概念理解不深，没有将无菌操作的理念与生产环节完美结合，所以出现失误就在所难免了。
笔者认为，作为一个食用菌职业工作者，必须正确理解无菌操作，在生产中的各个环节，每一个环节都要严格按照无菌操作的要求去做，才能保证最后的高产、稳产。
下面简要说明一下我理解的无菌操作理念，以供各位参考。
1. 培养基灭菌，有常压灭菌及高压灭菌，如何做到让培养基完全无菌，已经是很成熟很普及的技术，这里我看就不必多言了；2.正确了解“无尘即无菌”。
日常条件下，消毒灭菌好的培养基不能开放接种，就是因为未加处理的空气中存在大量的灰尘，大量的杂菌孢子及休眠体是附着在灰尘中飞来飞去的，所以将接种区空气中的灰尘完全除掉，也就是完全去除杂菌的过程。
工厂化接种车间，层流罩接种净化区，超净台接种区等，都是履行除尘程序，获得洁净空气的典范。
这里要求，不是在接种时才考虑除尘，在将培养基从灭菌锅取出等待冷却的过程中，就要讲究无尘，很多大规模生产基地和工厂化菇场的培养基冷却车间就已经基本做到了无尘化处理。
无菌注射操作流程
无菌注射操作流程
无菌接种步骤：（1）将初步洗涤及切割的材料放入烧杯,带入超净台上,用消毒剂灭菌,再用无菌水冲洗,最后沥去水分,取出放置在灭过菌的纱布上或滤纸上.（2）材料吸干后,一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀,对材料进行适当的切割.如叶片切成0.5cm平方的小块；茎切成含有一个节的小段.微茎尖要剥成只含 1-2片幼叶的茎尖大小等.在接种过程中要经常灼烧接种器械,防止交叉污染.（3）用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上.具体操作过程（以试管为例）是：先解开包口纸,将试管几乎水平拿着,使试管口靠近酒精灯火焰,并将管口在火焰上方转动,使管口里外灼烧数秒钟.若用棉塞盖口,可先在管口外面灼烧,去掉棉塞,再烧管口里面.然后用镊子夹取一块切好的外植体送入试管内,轻轻插入培养基上.若是叶片直接附在培养基上,以放1-3块为宜.至于材料放置方法除茎尖、茎段要正放（尖端向上）外,其他尚无统一要求.接种完后,将管口在火焰上再灼烧数秒种.并用棉塞,塞好后,包上包口纸,包口纸里面也要过火。
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食用菌接种室无菌操作及管理细则为规范接操作,提高接种成活率,特制定此细则,本细则适用于接种室接种操作人员,菌种室及相关人员参照执行。
1、接种室接种操作人员应有强得无菌操作意识,任何不规范或无意识得操作及行为都有可能给接种带来污染隐患,因此所有接种室操作及行为都应此细则为标准执行,细则之外得操作及行为经咨询主管人员并经同意后方可用于接种作业,同时我们将根据实际情况对本细则进行补充与完善。
2、接种室、缓冲间得消毒
接种室为高度无菌区,每天接种前2.5～3小时时段必须对接种室进行较为严格得消毒处理,消毒之前所有接种所需物件、菌种等必须一次性准备到位。
2.1菌种消毒
挑选好得菌种在接种室开始消毒之前应对菌袋表面进行药浴消毒,消毒所用药品为0。
１％高锰酸钾溶液,消毒时将菌袋浸入溶液中,并用抹布进行擦试,袋壁、袋颈、袋口及棉塞露于空气中得部位都应擦到,将擦洗完毕得菌种马上放到接种室即可以进行接种室得空间消毒作业。
2。
2接种消毒方法
接种室消毒时臭氧机开机时间为2小时,同时点3大包菇保一号辅导清毒;缓冲间５小包菇一号进行薰蒸、接种室消毒开始时间为每天早上得５:００～5:１5,下午为１1:１5～11:３0,接种时间上午不晚
于8:10,下午不晚于14:1０、臭氧机关时间将由时控开关自动控制,消毒人员不再进入缓种间手动关闭。
3、接种前准备
接种室、缓冲间均采用统进统出方式,严禁分批及无序进出,进入前所有操作人员必须将个人事情处理好,一旦进入直至接种完毕中途不得出入,进入缓种间后必须更换工作服、戴工作帽、穿专用鞋,换好后蘸取消毒液将双手洗净,然后同时进入接种室开始接种作业,进入缓冲间与接种室均应注意随手把门关好不留空隙。
4、接种操作
进入接种间先用７5％酒精把手、接种铲、剪刀及工作台面、垫板擦拭一遍并将接种铲、剪刀在酒精灯火焰上进行灼烧,然后可进行以下操作。
４.1将菌种袋棉花塞、套环拔掉用灼烧后得接种铲将料上表面0。
５ｃm左右得菌种刨掉弃之不用,所弃之菌种集中剩放于小桶内,做好后将菌袋倒置,并将袋口上折放于塑料筐内,注意袋口得密封,菌种不
可暴露于空气中。
4。
2碎化碎化操作推荐用完一袋处理一袋,也可以一次性将所有菌种碎化,但需注意碎化后得菌种必须密封好。
碎化时可采用揉搓等手法,但注意不要弄破袋壁或揉搓过度造成菌丝损伤严重,影响后续发菌、菌种碎化粒度要求其直径不大于０。
５cｍ。
4、3每接完一袋菌种,接种铲必须重新在火焰上进行灼一次,特别就是接触菌种得部位,灼烧时间应不短于２0秒,并有相应得冷却时间,
防止接种铲过热烫死菌种。
4。
4在菌种使用过种中,袋内菌种少不利挑取时,可用灼烧后得剪刀将菌袋上部剪掉,不可将剩余菌种倒入下一袋。
菌种若生有菇芽挑出弃除。
4.5接种中若发现菌种被污染,应立即将染菌菌种袋口拧紧放于小桶内,并重新对手及接种工具进行清毒。
４、6接种时菌包上得棉花塞要用右手小指与手掌夹住,不可放在操作台上,每个菌包接入三小铲菌种,接种时应一手扶菌包颈部,一手用接种铲挑取菌种接入,菌种应均匀铺满菌包下吕整个料面,并有不少于一铲得菌种落入接种孔中,接好后将棉花塞在酒精灯火焰上过一遍后塞入菌包、
５、清洁工作
5。
1每次接种完毕后均应清理垃圾及接种工具、台面、垫板、小桶、子等物件,其上不得留有料屑残渣等物,并用抹布蘸取2%来苏儿溶液擦拭一遍。
5.2地面料屑先用扫帚打扫干净,特别就是角落及轨道槽、打扫干净后再用2％浓度漂白粉或苏来尔溶液拖洗地面,洗净后将明水收干即可。
地面拖洗在每天下等接种完毕后进行,上午不进行拖洗,但要将料屑等垃圾清扫干净、
6、注意事项
6。
1接种室、缓冲间均为无菌区,消毒期间至操作完毕其门不可随意打开,工作人员进出必须统一行动,不可把缓冲间当休息室、聊天
室。
6。
2进入接种室严禁接打手机、听音乐、大声聊天等做与工作无关得事情,手机在进入接种室前一律关机。
6、3接种室地面必须每天拖洗,墙面每天应擦拭一次。
６.４接种铲应保持干净、光滑,不允许绑扎纤维质或杂菌易牺息得胶布等物。
６.5接种室消毒人员在消毒前应在菌袋之间插入温度计,接种人员进入接种室后由组长负责查瞧料温,若料温高于25 应停止接种。
6、6工作服、鞋、帽每星期至少洗涤一次,保持干净整洁。
每天接种完毕鞋底得料渣必须刮除干净。
6、７接种室电器设备要定期进行维护保养,电子净化机过滤网及电场每月必须清洗一次,臭氧机过滤海绵每月更换一次,并每天观察电器运行状态,如有故障及时进行修理与更换。
并定期进行空间无菌度得检测,确保生产平稳进行。