酶与细胞固定化特点与利用
合集下载
酶与细胞的固定化
变化少，因而酶活力损失很少。 参与交联的基团有: a-氨基, -NH2（Lys）, -SH(cys),咪唑基(His),酚基（Tyr),等
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶与细胞的固定化课件.ppt
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶的热稳定性
固定化果胶酯酶的pH稳定性
采用明胶作载体,戊二醛作交联剂 制备固定化果胶酯酶（焦云鹏，2005）
固定化果胶酯酶作用的最适温度
固定化果胶酯酶作用的最适pH值
5、酶的动力学特征 固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 二者电荷不同，因静电作用，固定化酶的表观Km值低于溶液的Km值； 电荷相同，由于亲和力降低，固定化酶的表观Km值显著增加。
Cefaclor(R1=H,R3=Cl) Cephalexin(R1=H,R3=Me) Cefadroxil(R1=OH,R3=Me)
酶促合成头孢类抗生素
CHCOOCH3 + H2N
NH2
O
S
Synthetase
N CH3
COOH
Esterase
CHCOOH +
NH2
CHCONH
NH2 O
S
N CH3
交联法有2种形式即酶直接交联法和酶辅助蛋白交联法。
酶直接交联法：在酶液中加入适量多功能试剂，使其形成不溶性衍生物。 固定化依赖酶与试剂的浓度、溶液pH和离子强度、温度和反应时间之间 的平衡。
酶辅助蛋白交联法：为避免分子内交联和在交联过程中因化学修饰而引起 酶失活，可使用第二个"载体"蛋白质（即辅助蛋白质，如白蛋白、明胶、 血红蛋白等）来增加蛋白质浓度，使酶与惰性蛋白质共交联。
二、固定化酶和固定化细胞的性质与表征 （一）固定化酶的性质 1、酶的活性 多数情况下固定化酶的活力常低于天然酶。原因：酶结构变化与空间
位阻。
2、酶的稳定性 大多数固定化酶具有较高的稳定性、较长的操作寿命和保存寿命。
酶和细胞的固定化
交联法
交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶 分子和交联试剂之间形成共价键的酶的固定化 方法。采用不同的交联条件和在交联体系中添 加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定 化酶。
交联法与共价结合法一样也是利用共价键固定 酶，所不同的是它不使用载体。交联法制备较 难，酶活损失较大，一般作为其他固定化方法 的辅助手段。常用的双功能试剂有戊二醛、己 二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中应用 最广泛的是戊二醛。
共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定 化方法，即将酶分子上非活性部位功能团与载 体表面反应基团进行共价结合的方法。一般先 用化学方法将载体活化，再与酶分子表面的某 些基团如羧基、氨基、羟基等反应，形成共价 键。
共价结合法的优缺点
共价结合法所得的固定化酶与载体结合比较牢 固，有良好的稳定性及重复使用性，成为目前 研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较 其他固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更 加严重。
缺点：但酶和载体之间结合力弱，pH、温度、 离子强度等条件的变化都易使酶从载体脱落， 并且污染催化反应产物。
离子结合法
离子结合法是酶通过离子键结合于具有离子交 换基的水不性载体上的固定化方法。此法的载 体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换 树脂，如DEAE-纤维素 、AmberliteCG-50 、 XE-97和Dowex-50等。
物理吸附法：是利用酶和载体间的非特异性物 理吸附作用将酶固定在载体表面，这些物理吸 附作用包括范德华力、氢键、疏水作用、静电 作用等。
物理吸附法的优缺点
优点：条件温和，工艺简便，载体选择范围很 大，吸附时既可实现酶的固定化又可以达到纯 化的目的，吸附后酶的构象变化较小或基本不 变，因此对酶的催化活性影响小。
如光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化 酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶，由于 条件温和，可获得酶活力较高的固定化酶。
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用－酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。
也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。
将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。
科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。
当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
被交联，酶活力损失大。
(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用
带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。
局限性：
(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的 副产物。 (2)只适用于生产胞外酶和其他能分泌到胞 外的产物 (3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限 制作用。
3.固定化原生质体
意义：
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
小结：
1.酶的固定化有几种方法？阐述其机理。 2.简述固定化原生质体制备的两个阶段。 3.固定化酶的应用主要在哪些方面，并举 例说明？（查阅资料）
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收利用。 3.产物的分离纯化困难。
★ 改善方法： 固定化生物技术
第一节 酶、细胞、原生质体固定化
一、定义及特点
1.固定化酶(imm在一定空间范围内进行催 化反应的酶。
借助双功能试剂使酶分子之间发生交
联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
(2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用
带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。
局限性：
(1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的 副产物。 (2)只适用于生产胞外酶和其他能分泌到胞 外的产物 (3)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限 制作用。
3.固定化原生质体
意义：
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
小结：
1.酶的固定化有几种方法？阐述其机理。 2.简述固定化原生质体制备的两个阶段。 3.固定化酶的应用主要在哪些方面，并举 例说明？（查阅资料）
第六章 酶、细胞、原生质体固定化
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收利用。 3.产物的分离纯化困难。
★ 改善方法： 固定化生物技术
第一节 酶、细胞、原生质体固定化
一、定义及特点
1.固定化酶(imm在一定空间范围内进行催 化反应的酶。
借助双功能试剂使酶分子之间发生交
联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛 O O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
固定化酶与固定化细胞
(2) 共价结合法
此法得到的固定化 酶结合牢固、稳定 性好、利于连续使 用，因此它是目前 应用最多的一类固 定化酶的方法。
借助共价键将酶的活性非 必须侧链基团或细胞表面 基团（如氨基、羧基、羟 基、巯基、咪唑基等）和 载体的功能基团进行偶联 以达到固定化目的方法。
共价偶联法的优点、缺点
共价偶联法的优点：得到的固定化酶结合牢固、稳定性 好、利于连续使用。 共价偶联法的缺点：载体活化的操作复杂，反应条件激 烈，需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 同时共价结合会影响到酶的空间构象，从而对酶的催化 活性产生影响。
ro
rb
NaCS
ri
NaCS
ra
固定化酶的制法及其特性比较
特性
共价键 结合法
制备方法
离子 结合法
交联法
物理 包埋法 吸附法
制法 酶活力 底物特异性
难 高 易变
结合能力 再生
强 不可
易 高 不变
难 中 易变
中 可能
强 不可
易 低 不变
弱 可能
难 高 不变
弱
不可
固定化酶的保存方法
一．真空冷冻干燥保存（长期保存） 二．低温保存 三．多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体
含羟基的载体可用三氯 三嗪等多卤代物进行活 化，形成含有卤素基团 的活化载体。
D．硅烷化法
多孔玻璃特点： 机械强度好，表面积大。 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生，寿
命长等。
D．硅烷化 法
一般常用的载体：多 孔玻璃，多孔陶瓷。
D
． 硅 烷 化 法
D
． 硅 烷 化 法
D．硅烷化 法
E ．溴化氰法
大小 和总吸附面积的大小。
酶及细胞固定化技术
酶及细胞固定化技术酶作为生物体内的催化剂，具有高效性和高特异性的特点。
但在工业生产中，酶稳定性差、易流失，造成成本过高，限制其广泛应用。
因此将酶采用固定化技术，使酶在发挥其高效、专一性同时，还能增强酶的贮存稳定性，提高了生产效率，节约了成本。
本文对酶和细胞的固定化技术进行综述。
【关键词】酶细胞固定化载体应用酶及细胞固定化技术是生物技术的重要组成部分。
20世纪60年代出现了固定化酶技术，60年代末固定化酶技术用于工业生产，70年代出现了固定化细胞技术，80年代又发展了固定化增殖细胞技术以及包括辅助因子在内的固定化多酶反应体系技术。
工程技术日益成熟，成为近代工业生产中不可缺少的组成部分。
所谓固定化技术，是指利用化学或物理手段将游离的酶或细胞（微生物），定位于限定的空间区域并使其保持活性和可反复使用的一种基本技术，包括固定化酶技术和固定化细胞技术。
固定化细胞的制备方法是多种多样的，任何一种限制细胞自由流动的技术，都可以用于制备固定化细胞。
一般来说，固定化技术大致可以分成吸附法、共价结合法、交联法和包埋法等4大类，其中以包埋法使用最为普遍。
一、固定化技术分类1.吸附法很多细胞都有吸附到固体物质表面的能力，这种吸附能力可以是天生具有的，也可以是经过处理诱导产生的，依靠这种吸附能力，人们发展起许多廉价而又有效的固定化方法。
吸附法可分为物理吸附法和离子吸附法，前者是使用具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂将细胞吸附到表面上使之固定化，是一种最古老的方法，操作简单、反应条件温和、载体可以反复利用，但结合不牢固，细胞易脱落。
后者根据细胞在解离状态下可因静电引力（即离子键合作用）而固着于带有相异电荷的离子交换剂上，如DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-纤维素等。
2.共價结合法共价结合法是细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。
第五章固定化酶和细胞
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。
在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素 主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的 性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物 分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载 体的空间位阻作用引起的。
本章 目录
5 固定化酶的应用
中通CO2气体进行反应 实现了辅酶的内部循环 该固定化系统表现出较好的
循环使用的稳定性
酶和辅酶 共固定化
（ Ei-Zahab, et al. 2008； Matsuda T. et al. 2009 ）
E2 E1
环氧琥珀酸水解酶生产L-(+)-酒 石酸
江苏 常茂生化
底 物
产 物
常茂生化利用凝胶包埋固定化含环氧琥珀酸水解酶的
DL-乙酰氨基酸拆分
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶与细胞的固定化 特点和利用
固定化生物技术——
通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位 于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复 利用。
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。 3.分离纯化困难。
第一节 酶与细胞的固定化
一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法 3)包埋法
例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一 种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌 体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然 保持活性，长期使用酶活力不减少。
实验： 2.4%左右的卡拉胶 ，70 ℃溶解, 再冷却到
42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃）
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方 法，与其它固定化方法相比： •优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变 酶的高级结构，酶活回收率高。 •缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法 共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
2. 固定化方法
1) 直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学 方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。
角叉菜胶包埋法： 滴至
角叉菜胶＋E (or cell)
KCl 溶液中
IE(or IC) IE (or IC)
聚丙烯酰胺凝胶包埋法： AP
Acr+ Bis+E (or cell) TEMED
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation）
又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微
交联反应既能发生在分子间，也可发生 在分子内。 • 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保 持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为 不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团 被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用 带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛有两个 醛基，均可与酶 或蛋白质的游离 氨基反应,使酶蛋 白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
2. 固定化细胞（immobilized cell）
固定在载体上并在一定空间优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
1.固定化酶(immobilized enzyme) 固定在载体上并在一定空间范围内进行催化
反应的酶。
什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。
网格型 微囊型
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用， 使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活性碳等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
常用的偶联反应有：重氮化法、 叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶的 空间构象而影响酶的催化活性。
迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
（三）原生质体的固定化方法
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。 常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉 菜胶和光交联树脂。 注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生 质体破裂。
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
纤维素
优点：条件温和，操作 简便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解 吸附。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体的功能 基团进行偶联。
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至
海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中
孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百
微米，厚约25nm。 半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透
膜孔径的小分子底物和产物可以自由进
出，被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入 体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免 遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。
固定化生物技术——
通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位 于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复 利用。
游离酶的缺点：
1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有 机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。 3.分离纯化困难。
第一节 酶与细胞的固定化
一、固定化酶和固定化细胞的定义及特点
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法 3)包埋法
例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一 种胞内酶。在50--80℃加热10分钟，使菌 体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然 保持活性，长期使用酶活力不减少。
实验： 2.4%左右的卡拉胶 ，70 ℃溶解, 再冷却到
42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃）
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方 法，与其它固定化方法相比： •优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变 酶的高级结构，酶活回收率高。 •缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。
吸附法 共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
2. 固定化方法
1) 直接固定法
不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学 方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。
角叉菜胶包埋法： 滴至
角叉菜胶＋E (or cell)
KCl 溶液中
IE(or IC) IE (or IC)
聚丙烯酰胺凝胶包埋法： AP
Acr+ Bis+E (or cell) TEMED
IE (or IC)
2）微囊型包埋法 （microencapsulation）
又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微
交联反应既能发生在分子间，也可发生 在分子内。 • 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保 持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为 不溶态。
缺点：
(1)反应条件激烈，酶分子的多个基团 被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用 带来不便。
4. 包埋法（entrapment）
3.交联法（crosslinking）
借助双功能试剂使酶分子之间发生交 联的固定化方法。
双功能试剂：
常用的是戊二醛
O
O
H — C — CH2 — CH2 — CH2 — C — H
戊二醛有两个 醛基，均可与酶 或蛋白质的游离 氨基反应,使酶蛋 白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
2. 固定化细胞（immobilized cell）
固定在载体上并在一定空间优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。
1.固定化酶(immobilized enzyme) 固定在载体上并在一定空间范围内进行催化
反应的酶。
什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。
网格型 微囊型
1.吸附法（adsorption）
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用， 使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换剂上。
根据吸附剂的特点分:
1）物理吸附法（physical adsortion） 作用力：氢键、疏水键 常用载体：氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
硅胶、羟基磷灰石、纤维素、活性碳等。 2）离子结合法（ion binding） 作用力：离子键 常用载体：DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-
2）偶联方法：
偶联成功与否取决于：
•载体：功能基团：芳香氨基，羧基， 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需基团：羧基，巯 基，羟基，酚基，咪唑基。
常用的偶联反应有：重氮化法、 叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。
•优点：酶与载体结合牢固，不会轻易 脱落，可连续使用。
•缺点：反应条件较激烈，易影响酶的 空间构象而影响酶的催化活性。
迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
（三）原生质体的固定化方法
一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。 常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉 菜胶和光交联树脂。 注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生 质体破裂。
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
纤维素
优点：条件温和，操作 简便，酶活力损失少。
缺点：结合力弱，易解 吸附。
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价键 将酶的活性非 必需侧链基团 和载体的功能 基团进行偶联。
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙
将酶用物理的方法 包埋在各种载体（高聚 物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高 分子半透膜中。
1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment）
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至
海藻酸钠溶液＋E (or cell) CaCl2 溶液中
孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百
微米，厚约25nm。 半透膜孔径<酶分子孔径，小于半透
膜孔径的小分子底物和产物可以自由进
出，被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入 体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免 遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。