第十章 固定化酶与固定化细胞技术
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
酶工程第10章固定化酶催化的动力学特征)
一些酶在溶液中和固定化后的米氏常数值
酶
底物
固定化试剂
肌酸激酶 乳酸脱氢酶 α－糜蛋白酶 无花果蛋白酶 胰蛋白酶
ATP NADH N-乙酰酪氨酸乙酯 N-苯酰精氨酸乙酯 苯酰精氨酰胺
无（溶液酶） 对氨苯基纤维素
当 Da <<1时，酶催化的最大反应速度要大大 慢于底物的传质速率，此时该反应过程由反应动 力学控制；当 Da>>1时，底物的传质速率大大慢 于酶催化的最大反应速度，此时该反应过程由传 质扩散控制。
外扩散限制效应
（2）作图法求[S]i值和Vi值
根据 Vm[S]i
Km [S]i
kLa ([S]0
[S ]0
[S]0 [S]0
外扩散限制效应
引入 [S] [S]i ， K K m ，并定义 Da Vm ，
[S ]0
[S ]0
k L a [S ]0
[S ]i
Vm [S]0 1 [S]i
kLa [S]0 K m [S]i
[S ]0
[S]0 [S]0
Da [S] 1 [S] K [S]
Viห้องสมุดไป่ตู้
Vm [S ]0 Km [S]0
V0
在这种情况下，酶反应速度不受传质速率的 影响，为该酶的本征反应速度，或称在此条件下 可能达到的最大反应速度，用V0表示。
外扩散限制效应
当外扩散传质速率很慢，而酶表面上的反应 速度很快，此时传质速率成为限制步骤。固定化 酶外表面上的底物浓度趋于零，有
Vi k L a[S ]0 Vd max
kLa ([S]0
[S]i )
酶与蛋白质工程固定化酶与固定化细胞演示文稿
酶和载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和 的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行 现已有多种偶联反应能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定作用，必须考
虑到酶的偶联效率，固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素
如，用乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，可以用
DEAE-纤维素载体有效固定。这种固定几乎是不可逆的吸附
此外，酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及
酶和载体的特性相关
➢ pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(±1-2pH单位)吸附
酶与蛋白质工程固定化酶与固 定化细胞演示文稿
当前第1页\共有48页\编于星期五\13点
（优选）酶与蛋白质工程固定 化酶与固定化细胞
当前第2页\共有48页\编于星期五\13点
固定化酶
固定化酶与水溶性酶比较具有以下优点：
(1) 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶液中没有酶的残留，简化 了提纯工艺
(2) 可以在较长时间内反复使用，有利于工艺的连续化、管道化 (3) 酶反应过程可以严格控制，有利于工艺自动化和微电脑化 (4) 在绝大多数情况下提高了酶的稳定性
(5) 较能适应于多酶反应
(6) 酶的使用效率提高，产物得率提高，产品质量有保障，成本低
当前第3页\共有48页\编于星期五\13点
固定化酶
砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每一葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可 与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶
当前第17页\共有48页\编于星期五\13点
例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗：将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2～3 次
↓ 发酵：将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，25 ℃下发酵 24 h
3．用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中，常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4．固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中，生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ，所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔， 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ，说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母菌就过少；海 藻酸钠浓度过高，不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近， 尤其是大分 子物质，反 应效率下降
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。
（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
（5）应用实例：生产高果糖浆①原料：葡萄糖②原理：葡萄糖果糖③生产过程及示意图：a.反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。
（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法：①物理吸附法 ：将酶（或细胞）吸附在载体表面上②包埋法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里③化学结合法：将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。
〖思考〗活化是指什么？在缺水状态下，微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注：加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中注：1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。
固定化酶与固定化细胞 ppt课件
• 固定化细胞意义：用完整的细胞作为生物催化剂， 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系 统。
ppt课件
4
优点
①省去对酶的提取过程，使酶的损失和生产 成本降到最低程度；
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
ppt课件
5
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
缺点：结合力弱，易解吸 附。
ppt课件
17
2.共价偶联法（covalent binding or covalent coupling）
借助共价 键将酶的活性 非必需侧链基 团和载体的功 能基团进行偶 联。
ppt课件
18
1）载体：亲水载体优于疏水载体
如:天然高分子衍生物:
纤维素
葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差
ppt课件
23
戊二醛有两 个醛基，均可与 酶或蛋白质的游 离氨基反应,使酶 蛋白交联。
此法与共价偶联法利用的均是共价键， 不同之处：交联法不使用载体。
ppt课件
24
交联反应既能发生在分子间，也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶 变为不溶态。
11
优越性：
(1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系
完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副
产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制
作用。
ppt课件
12
3.固定化原生质体
意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后， 由于载体的保护作用，稳定性提高。
固定化酶与固定化细胞
世界上第一种工业化生产的固定化
酶 乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸
乙酰 -D — Ala
.
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
.
2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模
最大, 应用最为成功 的一种固定化酶。
.
固定化方法
吸附法
包埋法 共价结 交联法
物理吸附法 离子吸附法
合法
制备难易 易
易
较难 难
较难
结合程度 活力回收
弱
中等
高，酶易流失 高
强
强
强
高
低
中等
再生
可能
可能
不能 不能 不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
不变
.
不变 可变 可变
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2.固定化方法
.
1.固定化细胞的分类
.
3.固定化原生质体
意义:
(1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩
散障碍，有利于氧的传递，营养成分
的吸收和胞内产物的分泌。
(2)原生质体不稳定，容易破裂，固定
化后，由于载体的保护作用，稳定性
提高。
.
二、固定化方法
（一）酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 (二) 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法 .
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
? 固定化酶技术从20世纪60年代发展的，被广泛应用于 酿造、食品、医药领域。
? 广义的固定化酶包括：
?
固定化辅酶
?
固定化细胞
?
固定化细胞器
? 一般来说，对于一步活两步转化过程用固定化酶较合 适；对多步转化，用整细胞。
第一节固定化酶
固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存 在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可 以回收重复使用。
(四) 交联法
? 是用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的 交联形成共价键,得到交联网架结构的方 法。
? 最常用的交联试剂是戊二醛，还有双重 氮联苯胺等。
以戊二醛为例说明如下 ：
（五）非共价结合法
? 对于在水不溶的有机相中进行的反应。 ? 包括： ? 1.结晶法—使酶结晶而实现固定化的方
法。 ? 2.分散法—将酶分散于水不溶相中实现
（二）最适pH的变化
影响固定化酶最适 pH因素主要有两个： 1.载体的带电性质 ；
负电的载体固定化酶，最适pH比游离酶高； 正电的载体固定化酶，最适pH比游离酶低； 电中性的载体固定化酶，最适pH一般不改变。
2.酶催化反应的产物性质。
产物为酸性时，固定化酶的最适pH比游离酶高； 产物为碱性时，固定化酶的最适pH比游离酶低； 产物为中性时，最适pH一般不改变。
一、固定化酶制备的方法
? 固定化酶的制备方法大致可分为4类： ①吸附法；
? ②共价结合法； ? ②交联法； ? ④包埋法。
（一）包埋法
? 它是一种用物理方法将酶包埋在高聚物 内，反应条件温和．并且不改变酶结构 的固定化方法。
? 包埋法又可分为 ? （1）网格型； ? （2）微囊型；
? 1．网格型：材料有聚丙烯酰胺、三醋 酸纤维、淀粉、硅胶、血纤维和胶原等。
固定化细胞
将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为 细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的 细胞称为固定化细胞。
特点： 1. 无需进行酶的分离和纯化。 2. 细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反应。 3. 酶的辅助因子可以再生，稳定性高。 4. 保持酶的原始状态，酶的回收率高。 5. 抗污染能力强。
胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、白土、 羧基磷灰石等； ? 有机载体：淀粉、离子交换树脂、琼脂 糖的烷基衍生物等；
（2）离子吸附法
? 酶通过离子键吸附于有离子交换基的载 体的固定化方法。
? 阴离子交换剂： DEAE-纤维素， DEAE- 葡萄糖凝胶等
? 阳离子交换剂： 羧甲基纤维素等
离子吸附法
? 优点： ? 1.操作简单； ? 2.条件温和； ? 3.回收率高； ? 缺点： ? 酶易脱落；
（三）最适温度变化
1.固定化酶的最适作用温度一般与游离 酶差不多，活化能也变化不大。
2.由于固定化后，酶的热稳定性提高， 所以最适温度也随之提高。
（四）固定化酶稳定性
? 固定化酶对热、各种变性剂的耐受性增 强，稳定性提高。
固定化酶稳定性提高的原因： ? 1. 酶分子与载体多点连接，可防止酶变
形； ? 2. 酶活力的缓慢释放； ? 3. 抑制酶的自降解；
? 2．微囊型：悬浮液被包裹在膜内，使 酶存于类似细胞的环境中，阻止了酶的 脱落。小分子底物则能迅速通过膜与酶 作用，产物扩散出来。
（二）吸附法
含酶水溶液和吸附剂接触，经洗涤除去 不吸附的酶便能制得固定化酶。 吸附法包括： ? （1）物理吸附法； ? （2）离子吸附法；
（1）物理吸附法
常用吸附剂： ? 无机载体：高岭土、膨润土、磷酸钙凝
蛋白质在载体上的吸附和解吸与下列因素有关。
? 1．pH ：PH 能影响载体蛋白质的电荷，
从而影响菌在载体上的吸附。一般情况 下，在蛋白质的等电点可以达到最大吸 附。 ? 2．盐：一般认为盐阻止吸附，盐也被 用来洗脱从低盐溶液中吸附的酶。 盐可以促进蛋白质吸附在惰性支持物上， 即称“盐析”吸附。
? 3. 酶浓度：一般在一定量载体上的吸附，总 是随酶浓度的增加而增加，直到饱和。
固定化的方法。
二、固定化酶的性质
（一）固定化酶的活性 ? 固定化酶的活性较水溶性酶有所下降。 ? 原因： ? 1.酶分子空间结构的变化，影响活性中心氨基酸。 ? 2.空间位阻影响底物与酶的定位作用。 ? 3.内扩散阻力影响底物与酶的接触。 注： ? 个别固定化酶活力增强可能是酶得到化学修饰或稳定
性增加。
? 4．温度：通常随 温度升高而增加酶的吸附 ， 但温度升高会造成酶失活的加速。
? 5．吸附速度： 酶在固体支持物上吸附速度 比较缓慢, 是由于酶的扩散速度较低所致。
? 6．载体：影响酶活力的重要因素是载体 表 面积、多孔度及载体的预处理 。
（三）共价结合法
? 酶蛋白分子上功能团和固相支持物上的 反应基团之间形成化学共价键的方法。
三、影响固定化酶的因素
酶本节 辅酶和辅基的固定化
原因 ? 辅酶固定化 方法
形式
辅酶固定化原因
载体的性质对固定化酶有很大影响：
? 1.载体应是亲水的，疏水载体与有机溶剂相同 的变性影响。
? 2. 载体也要求有一定的机械强度和稳定性。 ? 3.载体须具备能在温和条件下与酶结合的功能
团。 ? 常用的载体包括 : ? 1)天然高分子 (纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚
糖凝胶、胶原及其衍生物等 )， ? 2)合成高聚物 (尼龙、多聚氨基酸等 ) ? 3)无机支持物 (多孔玻璃、金属氧化物 )。
功能团: ? 酶分子N端:α-氨基，ε-氨基． ? 酶分子C端: 羧基、疏基、羟基、苯环
等。
? 优点：
? 酶和载体之间的连接很牢固，不会发生酶的 脱落，稳定性较好 。
? 缺点:
? 1.载体的活化或固定化 操作比较复杂，反应条 件也比较剧烈。
? 2. 若共价结合包含酶活性中心有关的基团， 会导致酶的活力损失 。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固 定化酶的过程。
固定化酶的形状： 颗粒---工业发酵 线条----工业发酵 薄膜---酶电极 酶管---工业生产（机械强度大）
固定化酶的特点
优点：1.可多次使用，且酶的稳定性提高。 2.反应后，酶易与底物和产物分开。 3.反应条件易于控制 。
缺点：1.费用太高。 2. 大分子的底物不易使用。