1聚合酶链式反应PCR技术
pcr技术的名词解释
pcr技术的名词解释PCR技术，全称聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），是一种在生物科学领域广泛应用的核酸扩增技术。
PCR技术可以在体外复制、扩增极微量的DNA或RNA片段，从而使其在实验室中进行更详细和准确的研究。
PCR技术是由美国科学家凯瑟琳·穆利斯（Kary Mullis）于1983年发明的，她因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
PCR技术的发明被视为生命科学领域的一项突破性发现，它极大地改变了基因分析和诊断的方式。
PCR技术的核心原理是通过一系列温度变化，使DNA模板序列在DNA聚合酶的作用下反复复制。
PCR技术通常需要以下几个步骤。
首先，从待扩增的DNA样本中提取出目标DNA序列。
提取DNA的方式可以根据实验目的不同而有所差异，常见的方法包括酚氯仿法、磁珠法等。
然后，将DNA样本置于PCR反应管中，并添加聚合酶、DNA引物（primer）以及四种碱基（A、T、C和G），混合均匀。
引物是一对短链的DNA片段，它能够特异性地与待扩增的DNA片段的两端结合。
接下来，将PCR反应管置于热循环仪中，进行一系列温度变化的循环。
通过加热至高温（通常为94-98摄氏度），使DNA双链解离成两条单链。
然后，降温到合适的温度（通常为50-65摄氏度），引物与目标DNA序列的两端结合，作为DNA复制的起始点。
最后，加热至适宜的温度（通常为72摄氏度），聚合酶将新的DNA链片段与引物结合，并复制出新的双链DNA。
上述温度循环通常需要重复20-40次，每一轮都会产生比前一轮更多的目标DNA序列。
因此，PCR技术具有极好的扩增效率。
PCR技术在生物科学中有广泛的应用。
它可以用于基因测序、基因突变检测、基因表达分析、DNA指纹鉴定等多个领域。
此外，PCR技术的快速和高效使其成为了病原体检测、法医学和生物工程等领域的重要工具。
总结来说，PCR技术是一种重要的核酸扩增技术，通过循环反应和温度变化的方式可以在实验室中迅速、准确地复制和扩增DNA或RNA序列。
聚合酶链式反应PCR基本原理
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是防止3′ 端旳互补重叠。
• ⑤引物与非特异扩增序列旳同源性<70%。
• ⑥引物旳3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做某些修饰。
• 2、PCR旳模板
• 欲扩增旳核酸片段是PCR旳模板。
• 能够是DNA，也能够是RNA。当用RNA作模板时， 首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正 常旳PCR循环。
3、耐热旳DNA聚合酶
• 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键旳原因 之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广 泛旳耐热DNA聚合酶。
• TaqDNA聚合酶旳功能是：以DNA为模板，以 四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点， 按5′→3′旳方向，以碱基配对方式合成 新旳DNA链。
寡核苷酸。
• 引物决定PCR扩增产物旳特异性和长度。 • PCR引物旳设计与PCR反应旳成败关系亲密。 • PCR反应中旳引物有两条，即5′端引物和3′
端引物，分别与相应旳模板链互补。
• 引物设计遵照下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基旳分布尽量随机，尽量防止多聚 嘌呤或多聚嘧啶。
二、PCR旳基本原理
• PCR技术实际上是DNA旳体外扩增技术。 • 其原理类似于DNA在体内旳复制过程。 • 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA
聚合酶、四种dNTP原料和合适旳缓冲液体系， 在一定旳温度下，经过反复旳过程，就能够 完毕DNA旳体外合成。
• 这些过程都是经过控制温度来实现旳，即经 过 变 化 温 度 引 起 变 性 （ denature ） 、 退 火 （ annealing ） 和 延 伸 （ extension ） ， 使 DNA得以复制。
聚合酶链式反应pcr实验报告 -回复
聚合酶链式反应pcr实验报告-回复聚合酶链式反应(PCR)实验报告引言：PCR，全称为聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，是一种用于迅速扩增DNA序列的技术，由凯里穆利斯于1983年首次提出，并于1985年由Mullis和Faloona首次报道。
PCR具有高灵敏度、高特异性、高效率等优点，广泛应用于基因组学、医学诊断、法医学鉴定、分子进化等领域。
实验目的：本实验旨在通过PCR技术，对DNA序列进行扩增，并测试PCR反应的影响因素，如模板DNA浓度、引物浓度、反应体系中酶和核苷酸的用量等，以优化PCR反应条件。
实验材料和方法：1.实验材料：1.1 模板DNA：提供两个已知DNA序列的模板，标记为M1和M2。
1.2 引物：两对特异性引物，标记为F1/R1和F2/R2。
1.3 PCR试剂盒：包括酶、缓冲液、dNTPs等。
1.4 ddH2O：去离子水。
1.5 1.5琼脂糖凝胶：用于电泳分析。
2.实验操作：2.1 PCR反应体系的配制：- M1反应：加入4μL M1模板DNA、1μL F1引物（10μM）、1μL R1引物（10μM）、12.5μL PCR Master Mix和6.5μL ddH2O，总体积为25μL。
- M2反应：加入4μL M2模板DNA、1μL F2引物（10μM）、1μL R2引物（10μM）、12.5μL PCR Master Mix和6.5μL ddH2O，总体积为25μL。
2.2 PCR反应条件设置：- 初始变性：94，4分钟。
- 变性：94，30秒。
- 结合：56，30秒。
- 延伸：72，1分钟。
- 延伸终止：72，7分钟。
- 等待：4。
2.3 PCR扩增：连续重复步骤2.2中的变性、结合和延伸步骤30次。
2.4 电泳分析：将PCR产物与DNA量标Marker混合，用1.5琼脂糖凝胶电泳分析。
实验结果：1. PCR扩增结果：在实验过程中，通过PCR成功扩增了M1和M2的DNA序列。
聚合酶链式反应(PCR)技术
实验十聚合酶链式反应（PCR）技术聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是美国Cetus公司人类遗传研究所的科学家K.B.Mullis于1985年发明的一种体外扩增特定基因或DNA序列的方法。
该技术是基因扩增技术的一次重大革新，是分子生物学发展史中的一个重要里程碑。
使用PCR扩增技术，可以将极微量的靶DNA片段特异地扩增上百万倍，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力。
PCR技术具有敏感度高、特异性强、快速简便等优点，在医学、遗传学、法医学、微生物学、食品检验、卫生检验等众多领域中具有巨大的应用价值和广阔的发展前景。
一、实验目的了解PCR技术的原理，学习建立PCR反应体系的原则以及掌握PCR操作的方法。
二、实验原理PCR技术模拟DNA的天然复制过程，在体外对DNA的特异序列进行扩增，从而获得大量的同一序列。
与扩增的特异性密切相关的因素是与待扩增的特异序列两端互补的两个寡核苷酸引物（上游引物和下游引物）。
在含有模板、引物、聚合酶以及其他成分的反应体系中进行以下反应：变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。
退火：使溶液温度降至50℃-60℃，模板DNA与引物按碱基互补配对原则结合。
延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，催化反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）按5′→3′方向和成互补DNA。
上述3步为一个循环，经历高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。
每经过一个循环，样本中的DNA量增加一倍；新一轮循环以新形成的链和原模板链作为模板，经过25-30个循环后DNA可扩增倍106-109。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、4种dNTP 混合物、MgCl2、引物、耐热Taq DNA聚合酶。
三、实验试剂及仪器1. 10×PCR buffer2. 引物3. DNA模板4. MgCl25. 4种dNTP混合物6. Taq DNA聚合酶7. PCR仪、凝胶成像系统、电泳系统四、实验方法1.2.反应体系混匀，离心；3.PCR扩增94℃变性1分钟36℃退火1分钟72℃延伸1分钟35-40 cycles4.72℃延伸反应5分钟。
PCR(聚合酶链式反应)技术与应用
PCR（聚合酶链式反应）技术与应用一．PCR技术的原理聚合酶链式反应（PCR）是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，即通过试管中进行的DNA复制反应，是极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍。
其反应原理与细胞内DNA复制相似，但PCR反应体系要简单得多，主要包括DNA靶序列、与DNA靶序列单链3’末端互补的合成引物、4种dNTP、耐热DNA聚合酶及适合的缓冲体系。
与细胞内的DNA复制相似，PCR也是一个重复地进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化形成新的DNA链的过程，这些过程都是通过控制反应体系的温度来实现的。
PCR包括下列三步反应：（1）变性（denaturation）：将反应体系混合物加热到94℃维持较短时间（大约15~30s），是目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA作为反应的模板。
（2）退火（annealing）：将反应体系冷却至特定温度（引物的T m值左右或以下），引物与DNA模板的互补区结合，形成模板-引物复合物。
必须精确的计算退火的温度以保证引物只与相对应的序列结合。
由于模板链分子较引物复杂得多，加之引物量大大超过模板DNA的数量，因此，DNA模板单链之间互补结合的机会很少。
（3）延伸（elongation）：将反应体系的温度提高到72℃并维持一段时间，引物在耐热DNA聚合酶的作用下，以引物为固定起点，以四种单核苷酸（dNTP）作为底物，合成新的DNA链。
因此，在这一阶段的末期，两条单链模板DNA又形成新的双链，且双链中的新生DNA单链具有各种不同的延伸长度。
以上三步作为一个循环重复进行，每一个循环的产物作为下一循环的模板。
因此，在第二轮循环中进行变性、退火、延伸这三步反应。
如此循环20次，原始DNA将扩增约106倍，而循环30次后将达109倍。
而所有上述过程将在1~2h内完成。
经过扩增后的DNA产物为大多介于引物与原始DNA相结合的位点之间的片段，而在反应前几轮循环产生的超过引物结合位点的较长链的DNA的比例将随着循环不断地进行稀释至可以忽略的程度。
PCR技术
Mg2+浓度
Mg2+是激活DNA polymerase的活性中心。 Mg2+对PCR的特异性和产量有显著的影响，在一 般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度以1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩 增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使 反应产物减少。
PCR反应体系的基本成分
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10×PCR Buffer MgCl2或MgSO4 dNTP Mixture (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 引物 (随机引物或特异引物) 模板DNA Taq DNA polymerase ddH2O
PCR引物设计的基本原则
合理的设计可在扩增的特异性和有效性之间找到一个平衡点。 1 引物长度通常18～30bp； 2 解链温度(Tm); Tm=4(G+C)+2(A+T) 3 GC含量以40%～60%为宜，GC太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非 特异条带；
PCR反应的基本过程
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模 板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以 便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后， 温③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如 TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板， 按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互 补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更 多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增 放大几百万倍。
PCR技术
环化 酶切体系中加入无菌水至终体积为 200ul，加 入200ul 氯仿 ：异戊醇(24:1）用涡旋仪混匀， 12000r/min离心5min; 取上清加入2倍体积 95%乙醇， 缓慢混匀后12000r/min离心5min,弃去液体，在管底 和管壁可见透明颗粒状沉淀，室温干燥DNA，溶解在 20ulTE溶液中。严格限制连接体系中DNA的终浓度小 于2ug/ml，连接环化体系为 500uL，连接酶300U/ug 用量为2ug连接过夜后，反应体系经酒精沉淀，溶解 在20ulTE溶液中，作为PCR反应模板。
目
录
PCR技术的概念及基本原理
PCR技术的反应体系
PCR技术的类型及应用
概念
PCR 技术 （聚合酶链式反应 ) 是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的 分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA复制， PCR的 最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
基本原理
PCR技术的基本原理类似于 DNA的天然复制过程，其特异性依赖 于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成，利用DNA在体外摄氏 95 度高温时变性会变 成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对 的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右） ，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
《肠道病毒71型的RT-PCR诊断及基因特征》 本文采用RT-PCR鉴定采集于手足口病疱液的10株 病毒，其结果与血清实验一致，鉴定出其中3株为 EV-71型，另外7株为Cox.A16。EV71常规的诊断方法 为病毒分离培养,中和抗体检测和免疫组织化学法。 EV71主要引起手足口病和中枢神经系统感染,而神经 毒力的基因特征的确定依赖分子遗传学的分析,这些 方法费时、费力,无法满足疾病流行期间同时处理大 量标本的需要。RT-PCR可以在疑似该疫情爆发时做 出及时正确诊断。
pcr技术的原理与应用和评价
PCR技术的原理与应用和评价1. PCR技术的原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，它能够在体外迅速扩增特定DNA片段。
PCR技术主要涉及以下步骤：1.变性：加热DNA模板，使其双链DNA解链，分离成两条单链DNA。
2.退火：降低温度，使引物结合到目标DNA序列的两端。
3.延伸：加入DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸（dNTPs），引物与模板DNA互补碱基配对，生成新的DNA链。
4.循环反应：重复以上步骤，使DNA的数量呈指数级增加。
PCR技术的关键在于引物的选择和反应的条件控制，引物应为目标DNA序列的互补序列，反应条件如温度、时间和酶的浓度要根据具体情况进行优化。
2. PCR技术的应用PCR技术具有广泛的应用领域，主要包括以下几个方面：2.1. 基因检测PCR技术可以用于检测和诊断遗传病、感染病以及肿瘤等疾病。
通过PCR扩增患者的DNA片段，并使用特定标记物进行检测，可以检测出目标基因的突变或存在。
2.2. DNA克隆PCR技术可以用于快速、准确地扩增特定DNA序列，提供大量的DNA片段用于克隆。
通过PCR扩增目标基因的DNA片段，可以得到足够多的DNA用于进一步的实验分析。
2.3. 基因测序PCR技术可以用于DNA的测序。
通过在PCR反应中加入低浓度的二进制缺陷错误生成的dNTPs，可以在扩增过程中引入随机的终止碱基，从而在PCR产物中生成不同长度的DNA片段。
通过对这些片段进行分析，可以确定DNA序列。
2.4. 基因工程PCR技术在基因工程中起着重要作用。
通过PCR扩增目标基因的DNA片段，并将其与其他基因片段进行连接，可以构建具有特定功能的DNA序列，用于基因表达和研究。
3. PCR技术的评价PCR技术具有许多优点，但也存在一些局限性，下面是对PCR技术的评价：3.1. 优点•高灵敏度：PCR技术可以在极低的起始DNA浓度下进行扩增，具有极高的灵敏度。
•高特异性：引物的选择保证了PCR只扩增目标DNA序列，具有高特异性。
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实验1 聚合酶链式反应（PCR）技术
【实验目的】
掌握PCR反应的原理及操作技术。
【实验原理】
PCR 技术实际上是在模板DNA、引物和4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于耐高温DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。
PCR 技术的特异性取决于引物和模板DNA 结合的特异性。
反应分为三步：1 热变性：在高温条件下，DNA 双链解离形成单链DNA；2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链；3 延伸：在DNA 聚合酶、dNTPs 和Mg2+存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的DNA 链延伸反应。
以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性DNA 片段得到了大量复制，数量可达到10 6~7个拷贝。
【器材与试剂】
1．器材
DNA 扩增仪（PCR 仪）、台式离心机、微量取液器、硅烷化的PCR 小管、琼脂糖凝胶电泳系统
2．材料
模板DNA，单、双链DNA均可作为PCR的样品。
3．试剂
(1) 10×PCR 缓冲液
(2) MgCl2 15mmol/L
(3) dNTP 混合物：每种2.5mmol/L
(4) Taq DNA 聚合酶：5U/μl
(5) 引物1和引物2：2 μmol/L
(6) 琼脂糖凝胶电泳试剂
【操作步骤】
1. 在0.2ml Eppendorf 管内依次混匀下列试剂，配制20μl 反应体系。
ddH2O 7.8 μl
10×PCR 缓冲液 2 μl
MgCl2（15mmol/L） 2 μl
dNTP（2.5mmol/L） 2 μl
引物1 (2μmol/L) 2 μl
引物2 (2μmol/L) 2 μl
模板DNA 2 μl
Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.2 μl
总体积20 μl
2．按下述循环程序进行扩增
程序阶段程序名称温度时间循环数
1 预变性94℃ 3 min 1
变性94℃30 sec
2 退火52℃30 sec
30
延伸72℃30 sec
3 保温4℃∞ 1
3．扩增结束后，取10μl 扩增产物进行电泳检测。
【要点提示】
1．在90~95℃下可使整个基因组的DNA变性为单链。
一般94~95℃下30~60sec。
时间过长使TaqDNA聚合酶失活。
2．退火温度一般在45~55℃。
退火温度低，PCR特异性差；退火温度高，PCR特异性高，但扩增产量低。
3．延伸温度一般在70~75℃。
此温度下TaqDNA聚合酶活性最高。
一般扩增产物长度小于1 kb，延伸时间30 sec即可。
当扩增产物长度大于1 kb时，可适当延长延伸时间。
4．引物长度通常用20bp左右。
两个引物扩增的片段大小300~500bp为宜。
【思考题】
1、PCR反应的原理是什么？
2、如何确定PCR反应中的退火温度和延伸时间？。