真核基因表达系统
真核细胞诱导表达系统研究进展
真核细胞诱导表达系统研究进展主要内容一．选题背景二．原核生物表达真核蛋白的缺点三．常见的几种真核表达系统四．总结与展望一、选题背景•随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。
利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段，但由于通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，因此，组成型表达系统的应用受到一定限制。
•基因工程的发展使许多微量蛋白得以大量表，使许多难以制备的蛋白得以表达。
大肠杆菌Ecoli表达系统是目前为止最为有效的和方便的表达系统，可以进行许多异源蛋白的高效表达，但在进行一些蛋白的表达时，会产生许多困难。
二、原核生物表达真核蛋白的缺点1、外源蛋白在E.coli中的大量表达是以不溶性的包涵体的形式存在于细胞内，而包涵体的分离破碎通常会造成目的蛋白的失活；2、真核基因通常含有内含子，在E.coli中是不能进行正确的剪切和拼接的，因此必须表达它的cDNA序列；3、真核生物的许多蛋白都是糖蛋白，用E.coli作为表达宿主，不能对真核蛋白进行正确的糖基化等翻译后加工，很难得到有活性的真核表达系统。
三、常见的几种真核表达系统1、四环素诱导表达系统2、蜕皮激素诱导表达系统3、生物素诱导表达系统4、哺乳动物细胞表达系统1、四环素诱导表达系统此系统的作用依赖于四环素调控的反式作用因子(tTA/rtTA)和反式作用因子依赖的启动子两个成分。
四环素反式激活蛋白(tTA)是一个包含大肠杆菌TN10四环素耐药操纵子阻遏物和单纯疱疹病毒p16蛋白(VP16)C端部分的融合蛋白,tTA依赖启动子由融合有RNA聚合酶Ⅱ启动子的四环素操纵子(tet O)基因序列构成,这种融合使真核细胞中的tet阻遏物成为很强的翻译激活物。
作用机理：在缺乏四环素及其衍生物的条件下tTA与tetO序列结合，使tTA依赖启动子的转录过程被激活；而在存在四环素及其衍生物的条件下，tTA无法与其靶位点相互作用，转录也就无法进行。
基因表达系统及技术
基因表达系统的研究意义
理解生命活动的基本原理 揭示疾病的发生和发展机制 提供新的药物靶点和治疗策略 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ动生物技术的发展和应用
基因表达系统的组成
转录因子
转录因子通过与DN结合调控 基因的转录过程
转录因子是基因表达调控的 重要因素
转录因子可以分为激活因子 和抑制因子
转录因子的种类和数量众多 具有不同的功能和作用
技术： CRISPR/Cs9、 TLEN、ZFN等
优势：高效、精 确、可重复性强
基因敲入技术
原理：通过基因编辑技术将目的基因插入到宿主细胞中实现基因表达 应用：基因治疗、基因工程、生物制药等领域 技术类型：ZFN、TLEN、CRISPR等 优点：高效、精确、可重复性高
基因编辑技术
基因编辑技术：CRISPR/Cs9技术 原理：利用Cs9蛋白对DN进行切割和编辑 应用：基因治疗、基因工程、农业育种等领域 优点：高效、精确、成本低 挑战：伦理问题、安全性问题、技术难题等
基因表达系统及技术
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基因表达系统概述
基因表达系统的定义
基因表达系统是指在生物体内基因通过转录和翻译过程将遗传信息 转化为蛋白质的过程。
基因表达系统包括转录和翻译两个阶段其中转录是指DN被复制为 RN的过程翻译是指RN被翻译为蛋白质的过程。
转录起始复合物
核心成分：RN聚合酶II、TFII、TFIIB、TFIIE、TFIIF、TFIIH 功能：启动基因转录 结构：由多个亚基组成包括核心酶、通用转录因子和特异性转录因子 作用机制：通过与DN结合形成转录起始复合物启动基因转录
分子生物学考试总结
PART Ⅰ基因（略）PART Ⅱ原核基因表达体系第五章细菌转录1、简介：转录产生的RNA链代表了DNA双链的一条链。
新合成的RNA链为5’-3’，而模板链为3’-5’。
转录出来的RNA 排列与编码链相同。
RNA合成由RNA聚合酶催化。
转录起始于RNA聚合酶与DNA上的特定区域的结合——启动子（promoter），这作为转录的开始。
从启动子开始，RNA聚合酶沿着模板链移动合成RNA，直到到达终止子（terminator）序列。
这一反应决定了转录单位的形成，即从启动子至终止子的序列均为转录单位，这一区域可能包含不止一个基因。
序列优先从起始点（转录RNA的第一个碱基）。
起始点以上的被称为上游，以下的被称为下游。
转录的直接产物被称为初始转录本。
它包含了从启动子至终止子的5’-3’的全部信息。
然而，转录起始本通常被直接修饰。
原核细胞中，它直接被降解（mRNA），或者切割成为成熟的tRNA或者rRNA。
转录只是基因表达以及调控的第一阶段。
调控蛋白决定了到底是哪一部分的基因能够被RNA聚合酶转录。
这一步骤决定了基因的转录与否。
本章需要谈论的问题主要有两个。
1、RNA聚合酶究竟是怎样找到DNA上的启动子序列的？推广这一问题为：究竟蛋白质是怎样阅读DNA上的序列来找到特定的结合位点的？2、调控蛋白是怎样与RNA聚合酶相互作用来启动或者抑制转录的起始、延长、或者终止过程的？2、转录发生在转录泡中：在通常意义上的转录过程中，RNA一般合成于“转录泡”中，转录泡为解开双螺旋的DNA 双链。
RNA链沿着5’-端向3’-端合成。
游离核苷酸的3’-OH与DNA链上的核苷酸的5’-P相互作用，合成RNA链。
RNA 聚合酶与启动子结合后就会解离DNA双链形成转录泡。
当RNA聚合酶沿着DNA模板移动时，其沿着解旋点（unwinding point）解开DNA双螺旋，并且在重旋点（rewinding point）重旋DNA。
转录泡的长度一般为12-14bp，但是RNA-DNA 杂交链区域的长度为8-9bp。
真核生物的基因表达调控
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• 锌指结构域The zinc finger domain
锌指结构有2种形式： C2H2 zinc finger和C4 zinc finger •C2H2 zinc finger：由12个氨基酸组成的环，通过2个半胱氨 酸（C，Cys）和2个组氨酸（H，His）残基固定，这4个残基 与Zn2+在空间上形成一个四面体结构。 一般情况下需要3个 或更多的C2H2型锌指才能与DNA结合，如在TFIIA有9个重复， 转录因子SP1有3个重复。 •C4 zinc finger： Zn2+与4个半胱氨酸（C，Cys）结合，存 在于类固醇激素受体转录因子中。
限定于结构域之内。
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反式作用因子的结构与功能
（1）概念：为DNA结合蛋白，核内蛋白，可使邻近基因开 放（正调控）或关闭（负调控）。
（2）通用或基本转录因子—RNA聚合酶结合启动子所必需 的一组蛋白因子。如：TFⅡA、 TFⅡB、 TFⅡD、 TFⅡE 等。 （3）特异转录因子( special transcription factors)—个别 基因转录所必需的转录因子.如：OCT-2：在淋巴细胞中特 异性表达，识别Ig基因的启动子和增强子。
(2) 动态模型（dynamic model）：认为转录因子与组 蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经 历结构上的改变，即染色质重塑。在染色质重塑过 程中，某些转录因子可以在结合DNA的同时使核小 体解体。
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组蛋白的乙酰化-去乙酰化 蛋白的乙酰化和去乙酰化是蛋白活性调节的一种 重要的形式，通过乙酰化或去乙酰化，改变了染色质 结构或是转录因子的活性，可以调节基因转录的活性。 组蛋白的乙酰化和去乙酰化能打开或关闭某些基因， 增强或抑制某些基因的表达。 组蛋白的8个亚基上有32个潜在的乙酰化位点。组 蛋白的乙酰化过程由组蛋白乙酰转移酶催化完成。
真核生物基因表达调控
酸性激活域 (D/E-rich) 谷氨酰胺(Q)富含域 脯氨酸(P)富含域
蛋白质-蛋白质结合域 （dimerization, co-factors）
1） TF最常见的DNA binding domain
Zinc Finger
bZIP
Homeodomain
bHLH
(1) 锌指(zinc finger)
2. The pri5’ capping 3’ formation / polyA splicing
3. Mature transcripts are transported to the cytoplasm for translation
Chromatin
epigenetic control
Protein degradation RNA silencing
一般而言的基因表达调控范畴
二、基因表达的时间性及空间性
（一）时间特异性
按功能需要，某一特定基因的表达严格按 特定的时间顺序发生，称之为基因表达的时间 特异性(temporal specificity)。
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His C-terminal: α-helix binding DNA
常结合GC box
(2) 碱性亮氨酸拉链 bZIP
(3) 碱性螺旋-环-螺旋bHLH
bHLH蛋白(basic Helix-Loop-Helix)
2） TF常见的trans-activation domain
– usually expressed at high level – the level of their gene expression may vary
原核、真核生物基因及表达调控
原核、真核生物基因及表达调控引言现代生物学中“基因”一词甚为流行，细胞学、遗传学、生物化学等，以及各种生物学课本中，都涉及到“基因”一词。
甚至象典型的宏观生物学科——生态学，也把一片森林称为一个“基因库”[1]。
现代生物学已经完全证明，DNA 分子是由称为核普酸的有机分子线性聚合而成。
基因就是核普酸按一定顺序排列而成的DNA分子片段，它携带着遗传信息。
基因表达(gene expression)是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
其实质就是遗传信息的转录和翻译。
在个体生长发育过程中，生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节），并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）[2]。
原核生物和真核生物的基因及表达过程有着差异。
随着世界分子生物学研究不断深入，基因表达技术有了很大的提高。
迄今为止，人们已经研究开发出多种原核和真核表达系统用以生产重组蛋白[3]。
一．原核、真核生物基因结构原核生物基因分为编码区与非编码区，所谓的编码区就是能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成，非编码区位于编码区的上游及下游。
[4]在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。
RNA聚合酶是催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。
真核生物基因结构见图1：图1 真核生物基因结构二．原核、真核生物基因结构的区别最主要的在于真核基因是不连续的,而原核基因是连续的。
所谓真核基因的不连续，即一个基因的编码序列也叫外显子，被一个或多个非编码序列，又叫内含子所间隔。
[5]这些内含子和外显子同属一个转录单位，转录形成前体。
经过转录的加工，即切去内含子，重新连按外显子，从而得到成熟。
而绝大多数的原核基因是连续的，没有内含子的间隔，转录产生成熟。
不仅如此，而且凡在代谢途径上功能有关的多个基因可能紧密相联，与它们的调控基因一起组成一个操纵子，转录到一条链。
分子生物学真核生物表达系统ppt课件
1
第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
往往只能在真核细胞表达系统中才 能获得有活性的表达产物。其原因
有：
12.02.2020
2
1、真核蛋白在原核宿主中不稳定
2、通过突变研究基因表达产物功能区 及关键位点
3、制备过量表达产物用于结构分析
12.02.2020
5
外源基因导入真核细胞的基本方法
病毒感染 化学法 转染
物理法
DEAE葡聚糖法 磷Байду номын сангаас钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 电穿孔法
显微注射法
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三、外源基因在真核细胞中表达的主 要方式
18
哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
12.02.2020
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（3）选择标记
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
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20
b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
真核生物表达系统汇总
2020年8月10日星期一
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哺乳动物细胞表达载体中常用的多腺苷酸化区
Poly A区
BGH SV40 late
TK SV40 early Hep B
来
源
牛生长激素 猿猴病毒40晚期基因 单纯疱疹病毒腺激酶 猿猴病毒40早期基因
乙肝表面抗原
效率
3 2 1.5 1 1
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（3）选择标记
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b、ADA基因：ADA基因编码腺苷酸 脱氨酶，Xyl-A经磷酸化转化为XylATP并结合到核酸分子中而导致细胞 死亡。ADA可以使之转变为肌苷衍生 物而解毒。
c、博来霉素抗性基因：
d、HPH基因：该基因编码潮霉素B磷 酸转移酶
1、瞬时表达：转染的DNA未与宿主 染色体整合，不能随宿主基因组的复 制而扩增，只能在细胞内维持2~3天 2、稳定表达：转染的DNA与宿主染 色体整合，能随宿主基因组的复制转 录和翻译，并被稳定遗传。
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五、外源基因在真核细胞中表达产物 的鉴定和纯化
mRNA的鉴定
蛋白产物鉴定
1)药物选择标记基因
a、APH或neor基因：新霉素、庆大霉
素及卡那霉素的结构类似物氨基糖苷G418可以干扰真核细胞核糖体的功能而 阻止蛋白质的合成。APH或neor基因编 码氨基糖苷磷酸转移酶，使G-418灭活。
转染细胞由于表达氨基糖苷磷酸转移酶， 因此可以在含G-418的培养基中生长。
2020年8月10日星期一
2020年8月10日星期一
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第一节 概述
在进行人的特定基因表达时，真核 细胞表达系统是首要的选择，尤其 是对于功能性膜蛋白、需要翻译后 修饰蛋白、分泌型蛋白和多蛋白复 合体中的蛋白组分等，这些蛋白质
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4. 真核生物基因编码复杂
原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺 乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约 90%的序列功能至今还不清楚。 原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物 为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含 子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获 得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳 动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。 真核生物mRNA 5’有帽状结构，3’末端有PolyA尾巴
Cis-acting factor
B gene
A gene
mRNA of A Protein A
mRNA of B Protein B
3、转录后的修饰
• 内含子的剪接
• 外显子的拼接 • mRNA的加尾和加帽
• mRNA的稳定性
4、翻译水平的调控
主要是microRNA对mRNA、tRNA 和rRNA的 调控
真核启动子结构模式图
上游启动子元件
核心启动子元件
哺乳类RNA聚合酶Ⅱ启动子中常见的元件
元件名称 TATA box GC box 共同序列 TATAAAA GGGCGG 名称 TBP SP-1 结合的蛋白因子 分子量 结合DNA长度 ~ 10bp ~ 20bp
30,000 105,000
CAAT box
结构基因周围能与特异转录因子结合而启动 转录的DNA序列，主要包括： • 起正性调节作用：启动子、增强子 • 起负性调节作用：沉寂子，终止子，加尾信号
启动子
位于基因5’末端与转录起始有关的核苷酸序列。作用特点是近距 离作用、具有方向性、空间位臵较恒定。一般包括
• 核心启动子元件（core promoter elements) ：
受体细胞
据受体细胞及表达载体的不同分为3种：
• 酵母表达系统
• 哺乳动物细胞表达系统 • 昆虫细胞表达系统
一、酵母表达系统
• 发酵简单、快速、便宜
• 真核生物，有翻译后修饰功能
• 可分泌表达，简化了纯化工艺
• 受体细胞安全
（一）酵母载体:
1、概念：
携带外源基因在酵母细胞中复制、扩增
和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。
1、转录前水平(基因组水平)： gene level
基因结构的改变、稳定持久、不可逆，组蛋 白修饰，DNA甲基化等
2. 转录水平调控
顺式调控元件(cis-acting element)
反式作用因子(trans-acting factor)
（1 ）顺式调控元件(cis-acting element)
1. 真核基因组巨大
大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级 大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因
2. 真核生物遗传信息复杂
原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍 体 真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹 在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加 了基因表达调控的层次和复杂性。
3. LiCl法：做成感受态细胞
四）外源基因在母菌中的表达
1、胞内表达：直接表达外源基因，
如：HBsAg的酵母重组疫苗
2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列，
pGAPZ,利用因子分泌表达
五）高表达的策略
（ 1 ）利用诱导型强启动子：毕赤酵母表达载体中常用启动能 力强的GAP启动子
（ 2 ）提高整合拷贝数：可利用载体中提供的抗生素遗传标记， 以抗生素加压筛选含有多拷贝的转化子。 （ 3 ）控制蛋白酶降解活性：采用蛋白酶缺陷型宿主菌，改变 发酵培养基的PH值，或在培养基中补加氨基酸或多肽，均可 避免产物被降解。 （4）分泌表达：也是一种避免产物被降解的良好策略。
• 酵母复制型质粒(Yeast replicable plasmid, YRp)
细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可 自主复制，但稳定性差 • 酵母附加子型质粒, YEp ：细菌质粒DNA+酵母标记基因 (YIp)+酵母2μM质粒，游离于核外存在并自主复制
酵母2μM质粒
• 增强子要有启动子才能发挥作用，但增强子对启动 子没有严格的专一性 • 无方向性（序列、位臵） • 远距离作用（1-4kB）
构建载体
• 无基因特异性
• 具组织特异性
沉寂子（silencer)或衰减子（dehancer) 是一类抑制基因转录的调控因子，作用方式
与增强子相同 转录终止信号： 控制基因转录的终止，由polyA上游的10-20bp处的加尾 信号（AATAA）和poly A下游的G/T簇构成
2、组成元件：遗传标记
调控序列
1）遗传标记：用于重组子的筛选和鉴定
营养标记基因：亮氨酸（Leu）
抗生素选择标记基因：Zeocin
2）调控序列
• ARS：酵母复制起始区(点)
• 酵母启动子：常用的有:
PGK(磷酸甘油激酶) GAP（3-磷酸甘油醛脱氢酶） ADH1(醇脱氢酶) SUC(蔗糖酶) Apase(碱性磷酸酶)
酵母双杂交系统
Yeast Two-Hybrid System
酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活 细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用 也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。 1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母 双杂交系统(yeast two-hybrid system)。蛋白的酵母双杂交实 验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相 互作用对真核基因转录调控影响的实验。
酵母表达系统(yeast expression system)
哺乳动物细胞表达系统(mammalian cell expression)
昆虫细胞表达系统(insect cell expression )
第一节 概述
一、真核基因组的复杂性
二、原核表达系统的局限性 三、真核表达系统的必要性及优势
一、真核基因组的复杂性
二、 原核表达系统的局限性
1、没有转录后的剪接和加工系统
2、缺乏翻译后加工修饰系统：不能进行糖基 化、磷酸化、甲基化的修饰，影响某些蛋白 的活性。
3、在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定
易被细菌蛋白酶降解; 难实现真正的分泌出胞，其产量很低; 而且容易 出现信号肽不被切割，或不在特异位臵上切割。 表达产物常以包涵体的形式存在，后期变性、复性的效率低
第八章 真核表达系统 Chapter 8 Eukaryotic expression system
内 容
• 概述( introduction ) • 真核基因结构及表达调控特点( Features of eukaryotic gene structure and regulation)
• 真核表达系统(eukaryotic gene expression system)
指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，决定基因转录的 精确起始位点产生基础水平的转录，包括：转录起始点及-30区的 TATA-box • 上游启动子元件（upstream promoter elements)
包括 -70到-80bp区域的CAAT盒及其两侧的GC盒，协同决定转录的 基础效率 • 组织特异性元件 • 诱导性启动子元件
Octamer
GGCCAATCT
ATTTGCAT
CTF/NF1 60,000 ~ 22bp
Oct-1 Oct-2 76,000 53,000 ~ 20bp ~ 23bp ~ 10bp 20bp
kB ATF
GGGACTTTCC GTGACGT
NFkB 44,000 AFT ?
增强子(enhancer) • 是一种能够提高转录效率的顺式调控元件
5、翻译后的调控
• • • • • •
切除信号肽 糖基化 乙酰化 磷酸化 甲基化 蛋白质的降解
第三节 真核表达系统
组成： 真核表达载体 受体细胞
真核表达载体
适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。
真核载体根据受体不同，又可分为几种：
• 酵母表达载体
• 哺乳动物细胞表达载体
• 昆虫杆状病毒表达载体
3. 真核生物基因协调表达
细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵子，共同 开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA； 真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是 单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵子的结构。
真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚 基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生 物基因协调表达要比原核生物复杂得多。
Features of Eukaryotic gene structure and expression
（一）真核基因表达调控特点 ---多层次、多方面
（二）真核基因表达的调控模式
真核基因表达的调控模式
( The regulating model of eukaryotic gene expression)
（2）反式作用因子(trans-acting factor)
由位于不同或相同染色体上相距较远的 基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控
元件和RNA聚合酶的相互作用而调节基因转
录活性。
P
Trans-acting factor
DNA
转录信号1
Trans-acting factor (DNA结合蛋白）
(3) 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC)----克隆大片段DNA