一些酶常用活力测定方法
酶活力测定
酶活力测定
酶是一种能够催化生物体内化学反应的蛋白质，广泛存在于动植物、微生物、真菌等
生物体内。
酶在生理代谢、免疫系统、消化系统等方面扮演着重要的角色。
因此，对于酶
的活力测定十分重要。
下面将详细介绍酶活力测定方法。
酶活力测定的基本原理是通过测定一个给定反应体系下酶所催化的底物转化速度来确
定酶的活力。
酶活力的测定通常采用标准曲线法、比色法、荧光法、放射性同位素标记法、酶电极法等多种方法。
其中，比色法和荧光法是最为常用的两种方法。
二、比色法
比色法是通过反应体系中某一底物和产物的比色反应来测定酶的活力。
常用的比色反
应有蛋白质和氨基酸比色法、尿素酶测定法等。
以蛋白质和氨基酸比色法为例，其测定步骤如下：
1. 选定底物，例如眼镜蛇毒素，反应物为酸性的巴氏液
2. 选定测定时点，例如反应20分钟之后
3. 加入颜色试剂，例如Folin验液，使反应产生深色络合体
4. 测定吸光度，根据标准曲线计算出反应深度，从而计算出酶的活力值
三、荧光法
荧光法是通过酶催化的底物转化产生的荧光信号来测定酶活力。
荧光法具有高灵敏度、高精度、高速度、低误差等优点，越来越受到人们的关注。
1. 选择荧光素为底物，荧光素在激发光的作用下会发出荧光信号
2. 酶催化荧光素转化为羟基荧光素，生产出更强的荧光信号
四、注意事项
酶活力测定的过程中需要注意以下几个方面：
1. 选择适当的反应体系、底物和试剂
2. 在测定前保持合适的反应条件（例如pH、温度等）
3. 为了获得比较准确的测定结果，需要进行多次测定
4. 保证测定设备和试剂的质量和准确性。
酶活力测定方法
蛋白酶活力测定: 参照中华人民共和国专业标准SB/ T10317-1999蛋白酶活力测定方法( Asha 等, 2007)。
纤维素酶DNS酶活力测定方法DNS, 活力, 纤维素酶, 测定1 定义1g固体酶粉在40℃和pH值4.2条件下，每分钟水解纤维素生成1微克葡萄糖的量为1个酶活力单位，以u/g表示。
2 原理纤维素酶分解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量，表示酶的活力。
3.试剂和溶液3.1 1％葡萄糖标准溶液（同β－葡聚糖酶酶活测定）3.2 羧甲基纤维素钠(CMC)溶液取1g羧甲基纤维素钠（粘度300～600厘泊）,加入pH4.2的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(甲液414ml和乙液586ml并用pH计校正至pH为4.2)混合均匀,水浴加热至溶,冷却后用2M 盐酸或氢氧化钠调节pH到4.2,定溶至100ml,再用二层纱布过滤，此溶液在4℃冰箱贮存，有效期3天。
取滤液100ml，20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。
3.3 DNS 试剂（同β－葡聚糖酶酶活测定）4仪器和设备4.1恒温水浴锅(40℃±0.2℃)4.2分光光度计含10mm比色皿，可在550nm处测量吸光度。
5测定步骤5.1 标准曲线绘制分别吸取1%葡萄糖标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml于50ml容量瓶中，用蒸馏水制成每ml分别含有葡萄糖0、200、400、600、800、1000、1200mg的稀标准液。
各取不同浓度的稀标准液0.5ml于试管中，加入CMC溶液1.5ml、DNS试剂3.0ml，于沸水浴中沸腾7min，取出后立即加入蒸馏水10ml混匀。
冷却后，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。
以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。
酶活力的测定 国标
木瓜蛋白酶活力的测定一、试剂与溶液1. 三氯乙酸称取三氯乙酸6.54g，用水溶解并定容至100mL。
2. L-酪氨酸标准储备溶液（100μg/mL）精确称取L-酪氨酸0.1000g，用1mol/L盐酸溶液60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸溶液。
吸取1mg/mL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的L-酪氨酸标准储备溶液。
3. 氢氧化钠溶液（20g/L）称取氢氧化钠2g，加水搅拌溶解。
待溶液到室温后，以水定容至100mL，搅拌均匀。
4. 盐酸溶液1mol/L:取22.5ml的浓盐酸溶液，加水定容至250ml。
0.1mol/L：取1.8ml的浓盐酸溶液，加水定容至200ml。
5. 酪蛋白溶液（10.0g/L）称取标准酪蛋白1g，用少量氢氧化钠溶液润湿，加入相应的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中100℃加热回流30min。
冷却到室温后转入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
使用前重新确认并调整pH至规定值。
二、分析步骤1. 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液：按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1 L-酪氨酸标准溶液分别取上述所配的溶液，以0管为空白，利用紫外分光光度计于波长275nm下测定吸光度。
以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度c为横坐标，绘制标准曲线。
利用回归方程，计算出吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K值。
其K值应在130~135范围内，如不符合，需重新配制试剂，进行实验。
2. 样品的测定待测酶液的制备：称取酶样品1g。
然后用磷酸缓冲溶液充分溶解，定容至50ml。
测定：先将酪蛋白溶液置于（40±0.2）℃恒温水浴中，预热5min，然后按以下流程操作：试管A（空白）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度试管B（酶试样，需三个平行样）↓加酶液2.00mL↓（40±0.2）℃，2min加酪蛋白溶液2.00mL（摇匀）↓（40±0.2）℃，10min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓取出静止10min，过滤（慢速定性滤纸）定容至100ml↓测滤液吸光度三、计算过程从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。
DNS法测定α-淀粉酶活力的方法
蒸馏水 （mL）2.0 1.6 Nhomakorabea1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量 （mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂 （mL）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。
预留发酵液酶活力测定 需要稀释倍数
10、100、1000、10000、 50000…… 对照设置1个就可以，10或100倍； 按照DNS方法测定。
酶 活 力 测 定 步 骤 （ 流 程 ）
1ml稀释酶液 40℃水浴保温5min
加入2.0mlDNS 40℃水浴保温10min
加入1.0ml1%淀粉溶液 （预先40℃水浴保温5min）
沸水浴5min 冷却定容至25ml
540nm作比色调 “0”、“100”用
1ml稀释酶液 40℃水浴保温5min
加入1.0ml1%淀粉溶液 （预先40℃水浴保温5min）
调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续 排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4， 1/5……）。
α-淀粉酶酶活力测定的原理
底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反 应一定量淀粉为糊精的时间） 产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原 糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生 成量（如DNS法），从而计算出酶活力单 位。
40℃水浴保温10min
加入2.0mlDNS 沸水浴5min
冷却定容至25ml
540nm比色测定 OD值
代入回归方程计算出麦芽糖生成量
计算公式
酶活力定义：在一定反应条件下（本实验为40 ℃ ， pH5.6或6.0），1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶 量定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶（酶 U/活 m ）L 麦 力芽糖毫 N 10
纤维素酶的三种活力测定方法
纤维素酶的三种活力测定方法纤维素酶是一种广泛存在于自然界中的酶类，具有重要的降解纤维素的功能。
对于工业生产、环境保护及生物能源等领域都有着极为广泛的应用。
因此，纤维素酶的测定方法也越来越受到研究者的关注。
本文将针对纤维素酶的三种活力测定方法进行详细介绍。
一、滴定法滴定法是最为简单、传统的纤维素酶活力测定方法。
其操作步骤相对较简单，但由于其受试物中的葡萄糖数量较小，因此准确度不如其他测定方法。
滴定法的具体操作步骤如下：1.采用苯酚褐或者硫酸铜-硫氰化钾将葡萄糖转化为光滑葡萄糖2.使用离子交换树脂净化试样3.通过酸水解，将可分离出的光滑葡萄糖转化为葡萄糖4.通过NaOH溶液中添加试样，测定试样所需要的NaOH溶液的体积二、反向相色谱法反向相色谱法是一种基于色谱技术的测定方法。
比滴定法更加准确且可靠。
反向相色谱法可以通过改变样品与固相载体的交互时间，实现对样品组分的分离。
其操作步骤如下：1.使用有机溶剂混合纤维素样品2.净化溶液，分离部分有机溶剂和水3.试样在反向相色谱柱上，随柱子流动4.通过检测器检测滴量，确定样品的浓度三、淀粉-纤维素显色法淀粉-纤维素显色法是一种基于酶法和化学显色技术结合的测定方法。
其同时测定酶反应的数量和反应的速率，可以获得相对准确的数据。
具体操作过程如下：1.样品中的淀粉与纤维素同时与碘反应2.通过求字头光度的变化及测试时间的变化，测定酶的活力3.以酶动力学为基础，通过数据分析得到相应的酶反应速率总结起来，以上三种方法均可用于纤维素酶的活力测定。
针对不同的需求，可以选择适当的方法进行测定。
其中，受试物的纯度和净化程度是影响精度的关键因素，因此在测定前要进行适当的纯化。
在生产过程中，可以选择淀粉-纤维素显色法作为主要测定方法，以保证产物质量的稳定性和可控性。
淀粉酶、α酶、β酶活力的测定
三、材料、仪器与试剂
(2) 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液A液：(0.1MOL/L柠檬酸)： 称取C6H8O7·H2O 21.01克，用蒸馏水溶解并定容至1L。B液： (0.1MOL/L柠檬酸钠)：称取NA3C6H5O7 · 2H2O 29.41克，用蒸馏水 溶解并定容至1L。取A液55毫升与B液145毫升混匀，即为0.1MOL/L PH=5.6的柠檬酸缓冲液。 (3)1%淀粉溶液：称取1克淀粉溶于100ML 0.1MOL/L PH=5.6的柠檬 酸缓冲液中。
Α-淀粉酶活力的测定
一、实验目的 二、实验原理 三、材料、仪器与 试剂 四、操作步骤 五、结果处理 六、思考题
一、实验目的：
• 学习和掌握测定α-淀粉酶活力的原理和方法
二、实验原理：
总淀粉酶活力测定过程中提取的淀粉酶原液主要包括Α-淀粉酶和Β-淀粉酶两种。 两种淀粉酶特性不同，A-淀粉酶不耐酸，在 PH=3.6的环境下以下迅速钝化。 Β 淀粉酶不耐热，在70°C环境下15分钟后就会钝化。根据它们的这种特性，在测定 活力时钝化其中之一，就可测出另-种淀粉酶的活力。 • 实验二采用加热的方法钝化Β -淀粉酶，测出A-淀粉酶的活力。 • 实验三采用加酸的方法钝化A-淀粉酶，测出Β -淀粉酶的活力。
四、操作步骤：
1.淀粉酶液的制备： 称取1g萌发3天的小麦种子(芽长约1cm)，置于研钵中，加入少量石英 砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定 容到100mL。在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟摇动1次，使 其充分提取。取适量在3000r/min转速下离心10min，上清液即为淀粉 酶原液，稀释后用于淀粉酶总活力测定(稀释倍数依具体情况而定)。
(2)还原糖测定： 将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温。用蒸馏水定容至20mL， 加塞后颠倒混匀。在分光光度计上(波长540nm)进行比色。
酶活性测量的方法有哪几种
酶活性测量的方法有哪几种酶活性测量是评估酶在特定条件下，催化底物转化为产物的能力的一种方法。
根据不同的酶特性和底物/产物的特性，可以使用多种方法来测量酶的活性。
以下是常见的酶活性测量方法：1. 比色法：比色法是最常用的测量酶活性的方法之一。
在酶催化底物转化为产物之后，产生的有色化合物可以通过分光光度计来测量其吸光度。
比色法适用于各种酶的测量，包括氧化还原酶、氨基酸酶等。
2. 荧光法：荧光法是利用酶底物转化为产物之后所产生的荧光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入荧光染料，通过测量荧光信号的强度来定量酶活性。
荧光法对于具有较高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如蛋白酶、DNA酶等。
3. 发光法：发光法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的光来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入发光底物或荧光染料，通过测量其发光强度来测量酶活性。
发光法对于对时间分辨率要求较高的酶活性测量非常有用，例如ATP酶、NADH酶等。
4. 放射性法：放射性法是利用酶催化底物转化为产物后所释放的放射性物质测量酶活性的方法。
该方法需要在底物或产物中引入放射性同位素，通过测量其放射性强度来定量酶活性。
放射性法对于具有极高灵敏度要求的酶活性测量非常有用，例如DNA聚合酶、RNA酶等。
5. 电化学法：电化学法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的电流来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入可反应的电活性物质，通过测量电流来定量酶活性。
电化学法对于某些具有电催化酶活性的酶测量非常有用，例如葡萄糖氧化酶、酒精脱氢酶等。
6. 色谱法：色谱法是利用酶催化底物转化为产物后所产生的物质在色谱柱上的分离来测量酶活性的方法。
这种方法通常需要在底物或产物中引入特定的标记物质，通过测量标记物质在色谱图谱上的峰面积或峰高度来定量酶活性。
色谱法对于某些底物或产物具有特定的分离性质的酶活性测量非常有用，例如激酶、酮糖酶等。
5酶类药物的分析检验
3.时间对照 若酶制剂不纯(含有产物)和底 物自发分解的情况并存，则必须做一个酶和底物 都加入但反应时间为零的对照，也即先用蛋白沉 淀剂或其它试剂停止反应，再加入底物。 在双底物反应时，对照管可以加入酶制剂和 两种底物中的一种，因缺乏另一种底物，不可能 生成产物，至于应加入两种底物中的哪一种可以 根据预实验决定。 测定管中的产物量必须减去对照管中的产物 才是真正由酶促反应所生成的产物量。
（二）酶活力测定的方法：
酶活力测定要符合两个原则： ①在零级反应期测定，即-〔s〕或〔p〕与 反应时间t成正比， ②反应速度与酶量成线性关系，即 〔E〕= k(-〔s〕/ t) = k〔p〕/ t k(k〔 常用的方法有： 1.定时法 2.连续检测法 3.平衡法
如何测定酶活力？ 如何测定酶活力？
以产物浓度对反应时间作图， 以产物浓度对反应时间作图，可得到酶促反 应速度曲线
产 物 浓 度
注意：初速度的 注意： 测定是关键， 测定是关键，为 什么？ 什么？
0
时间
可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 可见，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着时间的延长，反应速度逐渐下降 随着时间的延长，
国际单位的应用有利于比较同一样品中不同酶的活力。 但也有不少缺点，如 ：①从惯用单位换算成国际单位比较麻 烦；②某些酶作用于Mr不明的大分子底物(如淀粉酶、胃蛋白 酶等)，采用底物减少法来定量时，无法计算其底物减少的微 摩尔数；③ 同一种酶用不同的方法测定，换算成国际单位时， 其结果仍不相同。欧美各国由于地理条件及实验室内温度的 不同，常采用不同的测定温度，如25℃、30℃、37℃等，这 也导致即使用国际单位表示酶活力，其正常参考范围也是不 同的。
【重点掌握】 重点掌握】
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D 量热法
• 由于在反应过程中有反应热的变化，用 非常灵敏的量热计可以测定酶反应速度。
该法灵敏，无干扰，且很通用，近年来
逐渐引起了人们的重视。
E 旋光法
• 在某些酶催化的反应中，底物和产物的旋光有 所不同，这时就可以根据旋光的变化来跟踪酶 反应过程。在某些情况下，可通过形成络合物 来提高旋光度。如乳酸与钼酸盐反应形成高比 旋络合物，故可用旋光计跟踪 LDH 催化的乳酸 和丙酸之间的转换。然而，在通常情况下，由 于该法与其它方法相比灵敏度低，因而很少采 用
• 经同位素标纪的底物在酶活力测定中有很重要 的价值，用于标记的同位素一般有：
• 当同位素衰变时放出β 射线（粒子）。 • 放射性化学法原理与化学法相似，但反应终止 后，必须把放射标记的底物与产物分离，多用 层析和电泳法，然后测定产物（或底物）的放 射性，就可得知酶的活性。
3、酶偶联法
• 有一些酶促反应的产物不易直接测定，需加入一指 示酶转变成可测定的产物如测定葡萄糖氧化酶的反 应速度： • β —D—葡萄糖+ O2 →葡萄糖酸内酯+H2O2
酶反应速度和底物浓度的关系
V 反应速度
Vmax
1/2Vmax 混合级反应
零级反应一级反应Βιβλιοθήκη Km[S] 底物浓度
米氏方程
• v=Vmax[S]/(Km+[S]) • Km为酶反应速度达到最大反应速度一半 时的底物浓度，为酶的特征常数。 • 同一酶对不同底物Km不同。 • Km最小的底物为该酶的最适底物。
酶活力的测定
• 酶活力的测定就会是测定酶促反应速度。 • 必须测定酶反应的初速度。 • 底物浓度必须足够的大，至少为Km的10 倍。 • 酶浓度必须适合。
1、化学法
• 化学法是利用化学反应使产物变成一个 可用某种物理方法测定的化合物。如根 据比色、酸碱滴定、量热、量气法等来 计算酶的活性。
2、放射性化学法
酶的分析检测技术
• 酶促反应分析 • 酶活力测定方法 • 常见酶类的活力测定方法
維持酵素活性緩衝液
• 緩衝液可維持溶液的恆定酸鹼度及離子 濃度，兩者都會影響酵素的活性 • 經常在緩衝液中加入一些物質，以增加 酵素安定或保持活性 • 溫度的影響 • 濃度的影響
試劑的保存
• • • • 避免潮解 分裝凍藏: 甘油凍藏 避光防菌
术主要基于酶促反应的初速度原理，下
面介绍两种方法。
定时法
• 定时法是指在线性范围内，定时记录反 应过程中读数的变化（如吸光度），由 于这一变化值直接正比于初速度，故可 分析出相应的物质浓度。 • 这种分析仪多用分光光度法检测或选用 离子选择性电极，对大批量样品进行单 一成分分析或对每一样品进行多因素分 析，效率很高。
2、偶联的连续法
• 偶联的连续法就是将指示酶直接加到待 测酶反应系统中，将其产物直接或间接 转变成一个可用光谱吸收仪检测的化合 物。连续的偶联反应必须在酶反应相同 条件（ pH ，温度等）下进行，且加入的 指示酶，以及其他各种物质不能干扰原 来的酶活力。
四、酶分析的自动化
• 所谓酶分析的自动化是指从加样，启动 反应，检测、数据记录及结果处理等整 个过程都由仪器自动操作。自动分析技
B 电化学法
• 很多不同类型的电化学法已用于酶反应测定中， 最重要之一是电位计技术。其基本原理是溶液 的电势取决于被测物的浓度和性质，采用这一 原理制成的离子选择性电极，如pH电极可测定 酶反应过程中反应液pH值的变化，从而得知参 与反应的酶的活力。
C 量气法
• 在酶反应中底物或产物之一为气体时，可以通 过测量反应系统中气相的体积或压力的改变， 计算出气体释放或吸收的量。根据气体变化和 时间的关系，即可求得酶反应速度。最常用的 气 体 测 量 仪 为 瓦 （ 勃 ） 氏 测 压 仪 （ Warburg manometric apparatus ）。用测压仪测定酶活 力的优点是可以连续取得读数，以了解整个酶 反应的过程，缺点是灵敏度低。准确程度都较 光谱吸收法低。
酶反应的中止
• 使酶停止作用常使用强酸、强碱、三氯 乙酸或过氯酸，亦可用SDS（十二烷基硫 酸钠）使酶失活，或迅速加热使酶变性 等。酶反应的底物或产物一般可用化学 法，放射性化学法，酶偶联法进行测定。
三、连续法测定酶活力
• 连续法测定酶活力，不需要取样中止反应，而 是基于反应过程中光谱吸收，气体体积、酸碱 度、温度、粘度等的变化用仪器跟踪监测反应 进行的过程，记录结果，算出酶活性。连续法 使用方便，一个样品可多次测定，且有利于动 力学研究，但很多酶反应还不能用该法测定。
此反应可用量气法或氧电极法测定，但通过一指示酶二过 氧化物酶催化的反应测定吸收光谱的变化更为方便准确。
• H2O2 +色原（如愈创木脂）→H20+O2+染料
测定酶活力
• 中止反应法或连续反应法进行 • 中止反应法 • 在恒温反应系统中进行酶促反应，间隔一 定的时间，分几次取出一定容积的反应液，使 酶即刻停止作用，然后分析产物的生成量或底 物的消耗量。这是最古典的但仍是经常使用的 方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理，设 计测定其活力的具体方法。
切勿反復 凍結-解凍。
酵素失活的原因
• • • • • 可歸類成如下的物理性或化學性原因。 (1) 蛋白質 變性： (2) 酵素 活性區 破壞： (3) 蛋白脢 水解： (4) 酵素 抑制劑：
酶反应速度曲线
产 物 浓 度 斜率＝浓度/时间＝V 时间
酶反应速度可以通过单位时间内，单位体积中底物的减少量 或产物的增加量来表示。
1、一般的连续法
• A 光谱吸收法 • 该法主要指分光光度法和荧光法。分光 光度法是利用反应物和产物在紫外和可 见光部分光吸收不同，选择一适当的浓 度，连续测定读出反应过程中光吸收的 变化。该法适用于一些反应速度较快的 酶。自动记录仪的普遍使用使该法更容 易被人们接受。
• 脱氢酶以NAD+或NADP+或作为辅酶，反应中形成 NADH或NADPH ，340nm处可以观察到光吸收的变 化。 • NAD （ P ） H 在 340nm 处吸收光后发射出 460nm 的 光。因而，需这两个辅因子的任何反应都可用 荧光法测定。