原核蛋白可溶性表达策略及方案
可溶性GST-CRH蛋白原核表达条件的优化及纯化
可溶性GST-CRH 蛋白原核表达条件的优化及纯化郁硕1，陈锋2，刘英富3，霍景瑞2，李光宗2，张益2，丁辉2，樊毫军1△摘要：目的通过谷胱甘肽巯基转移酶（GST ）-促肾上腺皮质激素释放激素（CRH ）原核表达条件的优化及纯化，获得可溶性好、纯度高的重组GST-CRH 蛋白。
方法通过对GST-CRH 转化菌表达温度、菌液密度（OD 600）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度以及诱导时间的摸索，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）检测可溶性GST-CRH 蛋白的表达情况，GST 琼脂糖凝胶进行GST-CRH 的纯化，Western Blot 对表达的目的蛋白进一步鉴定。
结果起始OD 6000.8、IPTG 工作浓度0.1mmol/L 、30℃诱导8h 为GST-CRH 最优诱导条件；融合蛋白经Western Blot 鉴定为表达的GST-CRH ，纯化后纯度＞95%。
结论建立了GST-CRH 的原核表达及纯化方法，获得了高纯度的GST-CRH 可溶性蛋白。
关键词：促肾上腺皮质素释放激素；谷胱甘肽巯基转移酶；原核表达；纯化中图分类号：R392-33文献标志码：ADOI ：10.11958/20161302Optimization of prokaryotic expression condition and purification of soluble GST-CRH proteinYU Shuo 1,CHEN Feng 2,LIU Ying-fu 3,HUO Jing-rui 2,LI Guang-zong 2,ZHANG Yi 2,DING Hui 2,FAN Hao-jun 1△1Respiratory Department,the Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Henan 453000,China;2Institute for Disaster and Emergency Rescue Medicine,the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People ’s Armed PoliceForce;3Department of Cell Biology,Logistics University of Chinese People ’s Armed Police Force△Corresponding Author E-mail:fanhaojun999@Abstract:Objective To obtain the recombinant corticotropin releasing hormone (CRH)protein with soluble,highpurity protein through optimizing prokaryotic expression condition and purifying glutathione thiol transferase (GST)-CRH protein.MethodsTo detect the expression of soluble CRH protein through grope of the host strain GST-CRH temperatureof induction expression,the host strain concentration (OD 600),IPTG concentration and induction time,the purification of GST-CRH was performed by GST-CRH agarose gel.Western Blot assay was used for the expression identification of the target protein.ResultsThe optimal conditions for the induction of CRH protein were determined:temperature of 30℃,IPTG induced concentration 0.1mmol/L,bacteria density (OD 600)0.8,the induction time of 8hours,purified GST-CRH >95%fusion protein was obtained.ConclusionThe optimal expression conditions of GST-CRH are obtained,and thesoluble protein of high purity GST-CRH is also obtained.Key words:corticotropin-releasing hormone;glutathione s-transferase;prokaryotic expression;purification基金项目：天津市科技计划项目（14ZCDZSY00033）；全军重点实验室开放基金（JY1402）；武警后勤学院附属医院科研平台开放基金（WYFKFM201602、WYKFZ201603）作者单位：1河南新乡医学院附属医院呼吸内科（邮编453000）；2武警后勤学院附属医院救援医学研究所；3武警后勤学院细胞生物学教研室作者简介：郁硕（1988），男，硕士，住院医师，主要从事呼吸与危重症专业方面的研究△通讯作者E-mail ：fanhaojun999@促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasing hormone ，CRH ）能够刺激垂体促肾上腺皮质激素的释放［1］，是下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要调节者［2］，在应激反应中发挥着重要的调节作用。
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择
蛋白质可溶性的调控与表达系统的选择蛋白质是生命体中非常重要的一种分子，它们参与了细胞代谢的各个环节，并扮演着结构、信号传递、酶催化等多种重要角色。
在生物制药、基因工程等领域，大量需要生产蛋白质的需求，因此如何实现高效、高产、高纯度的蛋白质制备成为了很多人关注的话题。
蛋白质的可溶性是影响表达量的重要因素之一。
在表达载体中，蛋白质的可溶性受到多种因素的影响，包括蛋白质序列特性、温度、离子强度、pH、氧气含量、分泌效率等等。
若蛋白质处于不可溶性状态，不能在细胞内成功表达，无法用于下游纯化的需求，因此如何实现蛋白质的高度可溶性成为了一项非常有挑战性的任务。
为了提高蛋白质的表达效率及可溶性，人们进行了多种策略的研究。
其中如何选择适合的表达系统成为了一个重要的问题。
在基因工程领域，常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等等。
大肠杆菌是最常被使用的表达系统之一，因为其生长速度快、培养条件容易掌控、生产成本低、存储条件简单等优点。
不过，大肠杆菌的表达质量常常受到多种因素的影响。
一方面，由于培养条件不可避免地会造成蛋白质聚集和沉淀，因此大肠杆菌表达的蛋白质的可溶性常常较低。
为了解决这个问题，人们通常会选择使用特殊的大肠杆菌突变体，在其内部表达具有较高可溶性标签的蛋白质。
或者也可以在大肠杆菌表达完毕后使用特殊的离子交换介质等来进行可溶性的提升。
另一方面，传统的大肠杆菌表达系统往往难以表达复杂的蛋白质。
复杂蛋白质序列含有大量的游离硫酸氨基酸、脱氨基酸较多等特殊结构，使得其表达难度很高。
因此，一些新的大肠杆菌表达系统如T7表达系统、双RNA多样性补体表达载体等的诞生大大缓解了这个问题。
酵母菌在表达可溶性蛋白质方面也表现出了很高的潜力。
酵母菌表达系统包括酿酒酵母和毕赤酵母。
其中毕赤酵母表达系统因为能耐高温、高pH、高盐等多种恶劣环境而受到人们的青睐。
另外，毕赤酵母表达谷氨酰胺合成酶、重组十六烷酰体素生合成酶、融合菌糖神经酰胺合成酶等多种复杂重要酶的记录表现出出色的表达效果。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
原核表达(原理、材料与实验方案)
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
原核表达策略(200710)
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Solubility tags
Secretion signal
– pelB leader (22 amino acids) – ompT leader (20 amino acids)
Fusion to enzyme which promotes disulfide bonds
Part 1: Choosing a vector and cloning strategy Part 2: Selection of host and optimization of expression Part 3: Maximizing target protein recovery
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Bacterial Protein Expression
Vector
Host
Growth conditions
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Choices for Expression Plasmids
Level of control and expression Antibiotic selection Tag Solubility Protease recognition site Copy number
inNovations 15: 2(2002)
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expression of 8 proteins
1 2 3 4
Lanes: 1 pRSFDuet-1, pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1 combination 2 pCOLADuet-1, pACYCDuet-1, pETDuet-1, pCDFDuet-1 combination 3 Uninduced control 4 Perfect Protein™ Markers
原核表达操作步骤及注意事项
原核表达操作步骤及注意事项时间：2010-03-03 14:05:01 来源：作者：点击：1046次将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中，0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA 第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
大规模可溶性蛋白原核表达与纯化步骤
大规模可溶性蛋白纯化实验操作Hao Lab in SII1. 取20 µL E.coli BL21目的菌种加入装有10 ml LB培养基的50 ml离心管中，加入氨苄青霉素(Biobasic inc, #AB0028) 至终浓度为100 µg/ml或硫酸卡那霉素(生工，#0408) 至终浓度为50 µg/ml，37°C, 250 rpm, 摇菌过夜。
2. 取过夜培养的菌液8 ml加入400 ml (1:50) 含有相同浓度抗生素的LB中培养，间断检测菌液OD600值，37°C, 250 rpm, 摇菌大约60~120 min，待其OD600值达到0.6~0.8之间，加入0.4 mM IPTG (碧云天，#ST098), 30°C, 220 rpm, 诱导表达3 h。
3. 收集菌液至50 ml离心管中，7,000 × g, 4°C离心3 min, 弃上清收集沉淀，进行下步实验或置于-80°C冰箱保存。
摇菌用的锥形瓶用84消毒液浸泡或高压灭菌。
4. 将收集到的菌体重悬于20 ml 冰冷的Lysis buffer中，震荡混匀。
以下步骤均置于冰上。
5. 向菌体重悬液加入甘油至终浓度为10%，加入EDTA 至终浓度为0.5 mM，充分混匀。
6. 冰上超声：功率为仪器最大功率的60%，脉冲时间为1 s，间隔时间为1 s，总时间7~15 min。
7. 超声后的蛋白溶液于8,000 × g，4°C离心30 min。
15,000 × g, 4°C离心15 min可省略步骤10。
8. 在步骤7离心的同时。
取下20 ml新层析柱(Qiagen, #34964)的帽子并剪掉底部尖端再盖上帽子，加入混匀的50% NI-NTA beads (Qiagen, #S13-26-36-46; GST beads, GE, #17-0756-01) 悬液2 ml。
蛋白质可溶性问题及其在表达系统中的解决策略
蛋白质可溶性问题及其在表达系统中的解决策略蛋白质是细胞中最重要的生物大分子之一，它们在细胞内发挥着关键的生物学功能。
然而，许多表达系统经常遇到蛋白质可溶性问题，即蛋白质在表达过程中失去了其正常的可溶性结构。
这一问题严重影响了蛋白质功能的研究和应用。
本文将探讨蛋白质可溶性问题的原因以及解决策略。
一、蛋白质可溶性问题的原因1.1 蛋白质序列蛋白质序列在很大程度上决定了其可溶性。
一些蛋白质序列中含有高比例的疏水性氨基酸，这使得蛋白质容易聚集形成不可溶性沉淀。
此外，蛋白质序列中可能存在折叠障碍，导致蛋白质无法正确折叠形成可溶性结构。
1.2 表达条件表达温度、pH值等表达条件的选择也会影响蛋白质的可溶性。
不适当的表达条件可能导致蛋白质的不正常折叠、聚集或失去稳定性，进而降低其可溶性。
二、蛋白质可溶性问题的解决策略2.1 优化蛋白质序列通过对蛋白质序列进行合理的修改和调整，可以提高其可溶性。
一种常用的策略是引入疏水性氨基酸的替代，使蛋白质序列中的疏水性氨基酸比例降低，从而减少其聚集倾向。
此外，可以通过在蛋白质序列中插入构象稳定的序列或结构域，促进蛋白质的正确折叠和稳定。
2.2 调节表达条件合适的表达条件对于蛋白质的可溶性至关重要。
通过调节表达温度、pH值、培养基成分等参数，可以有效提高蛋白质的可溶性。
例如，降低表达温度有助于减缓蛋白质的聚集速度，同时增加蛋白质的折叠时间，有利于蛋白质正确折叠和可溶性的保持。
2.3 使用辅助蛋白质辅助蛋白质在表达系统中的应用可以通过促进蛋白质正确折叠和增强其可溶性来解决可溶性问题。
例如，分子伴侣蛋白可以与目标蛋白结合，提供适当的环境，促进其正常折叠和稳定。
此外，某些蛋白质互作可以通过与其他互补的亚单位结合来增加其可溶性。
2.4 优化翻译后修饰蛋白质的可溶性还受到其翻译后修饰的影响。
通过优化翻译后修饰酶的表达和调节，可以增强蛋白质的可溶性。
例如，合适的糖基化修饰可以提高蛋白质的稳定性和可溶性。
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原核蛋白可溶性表达策略及实验方案
可溶性表达策略
大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。
这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。
因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。
有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。
降低重组蛋白合成的速率
可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。
高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。
因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。
常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。
密码子优化
密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。
密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。
经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。
值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。
启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。
在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。
若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。
表达温度的选择
大肠杆菌的最适生长温度在37～39℃之间，但此温度下极易生成包涵体蛋白，降低可溶性蛋白的表达，而低温培养条件下表达外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。
由表可知：不同的外源蛋白低温表达时，可溶性蛋白的表达水平有明显提高。
但培养温度有一定下限（8～10℃），在此温度以下，蛋白基本上停止表达。
降低培养温度有利于重组蛋白合成速率的降低，因为蛋白质的合成较慢，新合成的蛋白质会有更充分的时间折叠，增加蛋白的正确折叠率的同时降低重组蛋白的降解速率。
培养基的组成
培养基的组成对可溶外源蛋白的表达有显著影响。
一般情况下，蛋白表达采用合成培养基，但合成培养基往往又存在菌体生长较慢和菌体浓度较低的问题。
外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖，可以用甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一。
在诱导时期，流加营养物质也有可能显著提高可溶蛋白表达。
考虑以下几点也可以提高可溶性蛋白的表达量：
向培养基中添加蛋白抑制剂也能提高可溶蛋白量；
1.外源蛋白二硫键的形成是一个酶依赖性反应过程，向培养基中添加适量的金属离子，可能提高这些酶类的活性，
因此也能增加可溶蛋白的表达量；
2.某些外源蛋白的活性和稳定性与某些金属离子密切相关，因此向培养基中添加外源蛋白所需金属离子也可能提
高蛋白的可溶性和稳定性；
3.良好的通气能有效降低培养基中对菌体表达蛋白有重要影响的CO2和乙酸的浓度，也有可能获得高产量的活
性蛋白；
4.培养基的pH值也会对可溶蛋白的表达产生重要影响，需要根据菌体和目的蛋白的特点选择合适的pH值。
诱导条件优化
诱导时间和诱导剂的用量也是控制可溶性外源蛋白表达的重要因素。
诱导剂种类及其浓度都会对外源蛋白表达产生重要影响，应根据所采用的表达系统(比如启动子的强弱)和外源蛋白的特点优化选择。
摇瓶培养时，应选用低菌体浓度诱导，因为在低菌浓度下菌体处于对数生长期，生长活跃，有利于表达可溶性蛋白。
然而，如果能保证合理的补料与充分的通气，在较高菌浓度下诱导也同样可能获得可溶蛋白的高效表达。
在某些情况下，诱导剂的流加能显著提高可溶蛋白的表达水平。
与分子伴侣或折叠酶共表达
分子伴侣的功能主要是通过阻止或校正不合理的疏水结合来帮助肽链形成正确的三维结构。
大肠杆菌的分子伴侣是由2个类型的蛋白质构成的，分别是Hsp60蛋白和Hsp10蛋白，二者都包含疏水区域，这些区域可与未折叠或错误折叠的多肽链结合，经过一个依赖ATP的过程帮助蛋白正确折叠。
将几种分子伴侣同时表达,有可能获得比单独使用更好的效果。
需要注意的是，共表达分子伴侣应根据重组蛋白自身的特点进行选择。
还有一个需要考虑的是培养温度，温度可能会对共表达分子伴侣的效果产生重要的影响。
案例介绍——可溶性蛋白条件优化
一、目的蛋白是否表达
1.挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL液体LB培养基中37℃，250rpm培养过夜；
2.将过夜培养菌液以1：100转接于含上述抗生素的100mL液体LB中，37℃，250rpm，
3.5h（大量培养至
OD600＝0.6左右）；
3.取出1mL菌液为未诱导的电泳对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养4h；
4.以未诱导菌液与IPTG诱导后菌液作对比，SDS-PAGE检测。
结果如下：
1：pET-32aA3未诱导
2：pET-32aA3未诱导
3：pET-32aA3诱导后
4：pET-32aA3诱导后
由图可知，目的蛋白经IPTG诱导后明显表达，分子量约为35kd。
二、表达的情况，是可溶还是沉淀
1.将上述的37℃诱导菌液离心（4℃，12000g，5min），弃上清（LB 培养液），沉淀重悬于0.9%NaCl 溶液
洗菌；
2.将重悬于0.9%NaCl 的菌体溶液离心（4℃，12000g，5min），弃
上清（0.9%NaCl 洗菌液），得菌体，称菌体重量，重悬于8mL PBS（pH 7.0）
缓冲液，缓冲液用量根据50~100mg/mL 的菌液终浓度；
3.超声破菌：冰浴条件下，超声波破碎大肠杆菌，超声设置如下功率：
400W，工作：15s，间隔：45s，全程时间：30min（30次左右）以菌液由白变透明，且不粘稠为依据；
4.将超声波破碎的菌液离心（4℃，12000g，15min），分别收集上清和沉淀，各取1mL，加入1mL 2×上样
缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE 检测。
由上图可知，目标蛋白在上清也有表达，即存在可溶性的表达，但是量很少，大部分也包涵体的形式存在（沉淀中），而包涵体的存在也证明了蛋白表达量很高，上清可溶蛋白的可操作性等因素都优于对包涵体蛋白的分离纯化，所以可通过探索可溶表达条件，最终来加大上清蛋白的含量，以利于下一步实验的进行。
三、探索可溶表达条件
影响包涵体形成的因素有很多，如诱导温度，诱导时间，IPTG 诱导表达浓度，摇床转速等等，所以设定在低IPTG 浓度下（0.1mmol/L），在不同温度，诱导时间下的表达对照：
∙
37℃250rpm 5h ∙
30℃180rpm 10h ∙23℃90rpm 30h
过程：挑取一单菌落接种于含氨苄(Amp，终浓度为100g/mL)的3mL 液体LB 培养基中37℃，250rpm 培养过夜。
将过夜培养菌液以1：100转接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL 液体LB 中，37℃，250rpm，3.5h （大量培养至OD600＝0.6左右）。
从60mL 培养液中取10mL 作为未诱导对照，标记3个50mL LB 培养菌液：
∙
37℃250rpm 5h ∙30℃180rpm 10h
1：pET-32aA3诱导上清
2：pET-32aA3诱导沉淀
∙23℃90rpm30h
都分5次取样：
∙37℃每一小时取样一次（取10mL）编号为：371、372、373、374、375
∙30℃每二小时取样一次（取10mL）编号为：301、302、303、304、305
∙37℃每五小时取样一次（取10mL）编号为：231、232、233、234、235
诱导培养结束后，将上述样品分别破菌离心，得上清与沉淀，加2×上样缓冲液，沸水浴10min，SDS-PAGE检测。
通过实验测定，选取不同温度下的最优可溶表达做比较（234,303,373），结果如下：
1：234上清
2：234沉淀
3：303上清
4：303沉淀
5：373上清
6：373沉淀
最终经过比对，确定23℃条件下，明显的提高了上清目的蛋白的含量，并且存在可溶表达平衡。
20个小时后，蛋白表达将以包涵体的形式存在，即不论如何改变条件，可溶表达已经达到极限。
所以无需探索更低温度等条件。