原核表达步骤
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
原核表达步骤
原核表达步骤原核表达是指在原核生物体内将基因转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质的过程。
本文将详细介绍原核表达的步骤。
1. 转录DNA的双链结构被酶RNA聚合酶解开，从而形成mRNA链。
RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，将mRNA链合成在一起。
在这个过程中，RNA聚合酶根据DNA模板链上的碱基序列，选择正确的核苷酸，将其加入到正在合成的mRNA链上。
2. 剪接在细胞核内，mRNA链是在原核生物上转录的。
这些mRNA链可能包含顺式调节区域（UTR）和内含子区域。
在剪接过程中，内含子被剪除，UTR被保留下来。
这个过程由小核RNA（snRNA）和蛋白质共同完成。
3. 翻译翻译是将mRNA链转化为氨基酸序列的过程。
翻译是在核糖体中完成的。
核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合体。
核糖体通过识别mRNA上的起始密码子来开始翻译过程。
起始密码子是AUG。
核糖体将氨基酸连接在一起，直到遇到终止密码子。
终止密码子分别是UAA，UAG和UGA。
翻译完成后，成品蛋白被释放出来。
4. 后翻译修饰在翻译完成后，蛋白质可能需要进行后翻译修饰。
这些修饰可以包括磷酸化，甲基化，硫化，酰化和糖基化等。
这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其生物学活性。
5. 折叠蛋白质被合成后，需要进一步折叠成其最终形态。
这个过程由分子伴侣和蛋白酶等分子机器完成。
分子伴侣可以协助蛋白质正确地折叠。
蛋白酶可以降解不正确折叠的蛋白质，防止它们对细胞造成损害。
6. 定位在折叠完成后，蛋白质需要被定位到其最终的位置。
这个过程由信号肽和其他分子机器完成。
信号肽是一段氨基酸序列，可以将蛋白质定位到细胞膜，内质网，线粒体等亚细胞结构中。
原核表达是一个复杂的过程，包括转录，剪接，翻译，后翻译修饰，折叠和定位。
这些步骤需要各种不同的分子机器和分子信号来协同完成。
理解原核表达的步骤可以帮助我们更好地理解生物学过程，从而为生命科学的研究和应用提供基础。
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤
5、 pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。
检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
若用PCR方法，可选用载体上的T7promoter （5‘载体特异性引物）and termintor（3‘特异性引物）引物中的一个和基因中的一个序列引物进行PCR验证，并可以判断插入方向。
6、DE3溶原菌的诱导表达
（1）从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50ug/ul 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac 启动子），继续培养2-3小时。
（3）将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
7、 SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）机械破碎细胞。
一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100ul可溶上清中加入100ul 4×SDS上样buffer和水。
85℃迅速加热3min 使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。
750ul20mMTris-HCl, pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min, 除去上清重复洗涤。
然后1.5ml 1％SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
原核表达实验流程
二．DＮA连接和转化
基本原理
Ｔ4ＤNA连接酶最初分离于T4噬菌体感染的大肠杆菌，可催化DＮA5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。在本试验中,将克隆载体pGEM-Ｔ与外源DNA片段用T4连接酶连接，可将外源DNA片段插入ｐGＥM-T质粒中，构建外源DNA的克隆载体。
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
(６)４℃用JＡ转头(或与之相当的转头)以2500rpｍ／ｍiｎ离心2０miｎ,以回收细胞。倒去培养液,用2５mＬ冰冷的10%甘油重悬沉淀。(甘油有保存细胞的作用)
（7）4℃用ＪA转头（或与之相当的转头)以2500rpm／ｍin离心20ｍiｎ，以回收细胞。倒去培养液，用1mL冰冷的１0％甘油重悬沉淀。(倾倒培养液时要小心，１0%甘油中的细菌沉淀附着力降低。)
(阳性）转化细胞１
酶切，获取目的基因
Peｔa／DH5a载体
重组
重组载体２
第二步
重组载体2DＨ5a感受态细胞
转化
转化细胞2
抽取质粒进行电泳
酶切验证检验阳性
(阳性）转化重组载体３
BL21感受态细胞
转化细胞３
诱导表达
蛋白质提取
SDＳ-ＰAＧＥ电泳检测呈阳性
目的蛋白
一.感受细胞的制备
体外连接的ＤNA重组分子导入合适的受体细胞才能大量增殖。为了提高受体菌摄取外源ＤNA的能力,提高转化效率以获得更多的转化子，人们摸索出了不同的方法处理细菌，使其处于感受态。目前主要采用电转化法和CａCl２ 法将外源ＤＮA导入受体细胞中，并需要相应地制备电转化感受态细胞和CaＣl2感受态细胞。本实验制备的是电转化感受态细胞。
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实验方法与步骤1 表达质粒的构建及测序分析1.1 cofilin-1的片段的准备1.1.1 引物设计根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用Primer Premier 5.0软件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR 引物。
引物如下：引物名称序列F-cofilin-1 5′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′R-cofilin-1 5′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃冰箱中保存备用。
1.1.2 cofilin-1片段PCR1 反应体系：2.5μlKOD polymerase(3’-5’核酸外切酶活性)KOD polymerase buffer 5μlMgSO4 2.5μlDMSO（“万能溶剂”） 2.5μldNTPMixture 5μlPrimerF（底物） 1.5μlPrimerR 1.5μlTemplate（模板）5μlddH2O 25μlTotal 50μl2PCR反应条件：①94℃预变性3min②94℃退火30s③65℃延伸40s④68℃40s⑤go to②30个循环⑥68℃5min⑦4℃forever3 琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测（1）配置浓度为1%的凝胶。
称取琼脂糖0.3g，加入30ml 1×TAE电泳缓冲液（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μl EB（溴化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，待凝胶完全凝结后拔除梳子。
（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后依次在加样孔中加入50μl Marker、50μl样品＋10μl loading buffer(上样缓冲液，可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以100V电压进行电泳。
（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝胶自动成像仪中分析。
4 割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用Omega Bio-Tek公司的Gel Extrection Kit进行回收：（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。
DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。
（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的binding buffer，55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。
（3）将Hibind DNA柱子套在2ml的收集管。
将上述步骤（2）的溶液转移至Hibind DNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。
（4）将柱子装回收集管中，加入300μl binding buffer，10000×g离心1min，弃滤液。
（5）将柱子装回收集管中，加入700μl SPW wash buffer，10000×g离心1min，弃滤液。
（6）重复步骤（5）一次。
（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。
（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。
13000×g离心2min，洗脱DNA。
1.2 表达载体pET-28a质粒的抽提接种含pET-28a的大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。
质粒抽提采用OmegaBio-Tek公司的Plasmid Mini Kit I进行质粒小抽：1 取－20℃冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5α菌种50μl接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养12h。
划平板，活化菌种，置于37℃恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37℃，180rpm 培养12h。
2 加入200μl GPS buffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000×g离心2min，弃去掉收集管中的废液，柱子平衡完毕。
3 将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000×g离心1min，彻底去除上清，收集沉淀菌体。
4 加入200μl Solution I/RNase A混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。
5 往重悬液中加入200μl Solution Ⅱ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温放置2min，至溶液变成澄清。
6 加入300μl Solution Ⅲ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。
室温下，10000×g离心10min。
7 取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。
室温下，10000×g离心1min，弃滤液。
8 将柱子装回收集管中，加入500μl HiBind buffer。
室温下，10000×g离心1min，弃滤液。
9 将柱子装回收集管中，加入700μl Wash Solution。
室温下，10000×g离心1min。
重复该步骤一次。
10 重复步骤9一次。
11 弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。
12 将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。
13000×g离心2mi。
跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。
-20℃冰箱中保存备用。
1.3 cofilin-1片段和表达载体的双酶切用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1 cDNA和表达载体pET-28a，37℃水浴反应4h，反应体系如下：表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：表达载体15μl cofilin-1片段10μl92μl10×H Buffer 2μl 10×H Buffer（ＬＭＨＫＴ代表缓冲液中盐浓度或成分不同）XhoI 1μl XhoI 1μlNdeI 1μl NdeI 1μlddH2O 1μl ddH2O 6μlTotal 20μl Total 20μl1.4 酶切产物的回收酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。
步骤同PCR反应产物胶回收。
1.5 连接反应将PCR产物cofilin-1 cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收产物于16℃连接24h，反应体系如下：cofilin-1 cDNA酶切回收产物18μlpET-28a酶切回收产物6μl10× T4 DNA ligase buffer 3μlT4连接酶3μlTotal 30μl1.6 感受态大肠杆菌DH5α的制备（将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，诱导细胞成为感受态，细胞通透性发生改变，在短暂的热刺激后，细胞膜出现许多间隙，外源DNA被细胞吸收，通过复制，表达，实现遗传信息的转移，将转化后的细胞在选择性培养基上培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆）1 于-20℃冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5α菌种，于LB固体培养基上划平板，置于37℃恒温箱中培养过夜。
挑单菌落，接种试管4ml LB培养基中，37℃，180rpm培养12h。
2 将试管中的菌液按1%的接种量接种到含50ml LB培养基的锥形瓶中，37℃，180rpm，培养2-3h，当OD600=0.3~0.5时，停止摇菌。
3 将锥形瓶中的菌液分别倒入两个已灭菌的50ml离心管中，于冰上放置10min 左右。
4 4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。
5 加入20ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，4℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。
6 加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，加甘油至终浓度为15%，分装于1.5mlEP管中，转移-80℃保存备用。
1.7 连接产物的转化1 将感受态大肠杆菌从-80℃冰箱中取出后，立即放在冰上，让其慢慢融化。
2 将16μl连接产物加入100μL感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰浴30min。
3 将Eppendorf管放入42℃水浴箱中热冲击90s，再迅速冰浴1-2min。
4 于EP管中加入400μl LB培养基，置于摇床上，37℃，50rpm培养45min。
5 将转化后的菌液涂于LB固体培养基上(含卡那霉素20μg)，置于37℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
1.8 双酶切鉴定重组子1.8.1 双酶切鉴定和PCR鉴定1 从接有重组菌落的平板中挑取单菌，落接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）的试管中，37℃，180rpm培养12h，OMEGA质粒抽提试剂盒抽提质粒。
3 限制性内切酶Nde I和Xho I酶切转化子质粒，将反应物置于37℃水浴箱中水浴4h。
反应体系如下：质粒pET28a-cofilin-1 1μl10×H Buffer 1μlXhoI 1μlNdeI 1μlddH2O 6μlTotal 10μl4 电泳分析。
将酶切产物、抽提出的未经酶切的质粒和PCR鉴定的反应产物一起进行琼脂糖凝胶电泳分析1.8.2 重组子的序列分析挑选经双酶切鉴定和PCR鉴定呈阳性的含重组子的菌落，接种到4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃、180rpm过夜12h，15％甘油保种（甘油有隔绝空气，衡湿，调节渗透压，并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用）。
并送样品英骏公司测序。
2 cofilin-1在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达2.1 感受态大肠杆菌BL21(DE3)的制备具体方法和步骤同1.6。
2.2 重组质粒pET28a-cofilin-1转化BL21大肠肝菌感受态细胞取鉴定正确的重组质粒pET-28a-cofilin-1转化入感受态的大肠杆菌BL21(DE3)，具体方法和步骤同1.7。
于LB固体培养基（含卡那霉素20μg）上划平板，并筛选阳性单克隆。
2.3 cofilin-1的诱导表达挑单菌落，接种于4ml LB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养至OD600=0.8～1.0。
取1ml作未诱导对照，其余加IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，是一种极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，诱导β-半乳糖苷酶活性，在平板中加入IPTG，可以根据是否呈现白色菌落或噬菌斑而方便挑选出基因重组体）至终浓度1mmol/L，在37℃下诱导4h。