原核表达
原核表达
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
原核表达(原理、材料与实验方案)
原核表达（原理、材料与实验方案）一、原理1、E . coli表达系统E . coli是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
原核表达系统的工作原理
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
PET系统_原核表达详细总结
04
应用前景展望
在生物制品领域的应用前景
1 2
疫苗生产
利用PET系统进行原核表达，可实现疫苗抗原的 高效制备，降低生产成本和时间。
抗体药物生产
通过PET系统表达抗体，能够简化抗体药物的生 产流程，提高生产效率和产品质量。
3
生物制品质量控制
PET系统可用于生物制品质量控制，如蛋白质结 构鉴定、功能检测和残留物质检测等。
疾病机制研究
PET技术可用于研究疾病的发 生机制、发展过程和治疗方法 ，有助于深入了解疾病的本质
。
医学影像诊断
PET技术能够提供高灵敏度和特异 性的医学影像，有助于肿瘤、神 经系统疾病等疾病的早期诊断。
生物医学材料研究
通过PET技术对生物医学材料进行 标记和检测，能够提高材料的安全 性和有效性。
05
培养基
提供实验菌种生长和繁殖所需的营 养成分。
试剂和仪器
包括各种分子生物学试剂和细胞培 养设备，用于实验操作。
实验方法
活性检测
通过生物学活性检测，评估目的蛋白的功 能和效果。
目的基因克隆
将目的基因从染色体或质粒上克隆到表达 载体中。
表达载体转化
将克隆好的表达载体转化到实验菌种中。
蛋白纯化
采用各种纯化技术，将目的蛋白从细胞中 分离出来。
诱导表达
通过添加诱导剂或其他方法，启动目的基 因的表达。
02
实验结果
pet系统表达的蛋白质量分析
总结词
在利用PET系统进行原核表达的过程中，需要关注蛋白的质量和产量。
详细描述
通过SDS-PAGE和Western Blot分析，可以检测到目标蛋白的分子量标准，同时利用定量蛋白试剂盒可以测定 其浓度。
原核表达系统
05
原核表达系统的研究进展
研究现状
基因克隆技术
随着基因克隆技术的发展，越来 越多的基因被成功克隆并用于原 核表达系统中，为生物制品的制 备提供了更多选择。
表达载体构建
原核表达系统中的表达载体是关 键因素，目前已经构建了多种高 效表达载体，能够实现外源基因 的高水平表达。
宿主菌选择
宿主菌的选择对原核表达系统的 表达效果至关重要，经过不断筛 选和改良，已成功应用于生产实 践的宿主菌种类不断增加。
通过原核表达系统可以大量制 备蛋白质，用于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物组装。
蛋白质工程改造
利用原核表达系统可以对蛋白 质进行体外进化、定向改造等 ，提高蛋白质的特性和功能。
在生物科学研究中的应用
蛋白质组学研究
生物信息学研究
原核表达系统可用于蛋白质组学研究， 大量制备蛋白质并进行分析，揭示蛋 白质的结构和功能。
原核表达系统
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原核表达系统的基本原理 • 原核表达系统的应用 • 原核表达系统的优缺点 • 原核表达系统的研究进展 • 结论
01
引言
主题简介
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）作为宿主细胞进行 目的基因表达的技术。
它具有操作简便、成本低廉、表达量高等优点，广泛应用于基因 工程、蛋白质工程等领域。
翻译过程中，宿主菌的 核糖体识别mRNA上 的起始密码子，开始翻 译目的基因，合成蛋白 质。
通过调控启动子和终止 子等元件，可以控制目 的基因的表达水平和方 向。
03
原核表达系统的应用
在生物制药领域的应用
80%
生产重组蛋白药物
原核表达系统可用于生产重组蛋 白药物，如胰岛素、生长激素等 ，用于治疗各种疾病。
PET系统_原核表达详细总结
目的基因在原核细胞内表达出目的蛋白，通过 分离纯化获得高纯度的蛋白质产物。
原核表达系统的优缺点
• 优点 • 高效：可实现大规模、工业化生产。 • 快速：可快速鉴定目的基因的功能和性质。 • 灵活：可随时对目的基因进行改造和优化。 • 成本低：操作简单，节省人力物力财力。 • 缺点 • 不稳定：表达水平受多种因素影响，如培养条件、质粒拷贝数等。 • 安全性：可能存在潜在的安全风险，如产生毒素和免疫反应等。 • 修饰能力差：原核生物的蛋白质修饰能力有限，不能像真核生物一样进行复杂的修饰。
蛋白质修饰
原核表达系统可以用于研究蛋白质的翻译后修饰，例如磷酸化、糖基化等，有助 于深入了解蛋白质的功能和生物学意义。
生物信息学分析
生物信息学是利用计算机科学、统计学和生物学方法，分 析生物学数据并挖掘其中的规律和意义。原核表达系统产 生的数据可以用于生物信息学分析，例如基因和蛋白质序 列的比对、结构和功能预测等。
通过开发自动化、智能化生产设备和改进工 艺流程，提高生产效率和质量均一性，提高 产业化能力。
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均一性等方面都存在差异，需要根据产业化要求进行选择。
原核表达系统技术平台的优化方向
提高表达水平
改善产品质量
通过基因工程手段改造宿主细胞和目的基因 ，提高目的基因在细胞内的表达水平。
通过优化表达载体和宿主细胞，改善目的产 物的质量，例如分子大小、糖基化修饰等。
降低生产成本
提高产业化能力
通过优化培养基配方、提高细胞密度和降低 副产物生成等手段，降低生产成本。
03
pet系统与原核表达系统的关系
pet系统中原核表达系统的应用
《原核表达系统》课件
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）进行基因表达的方法。通过将外源基因插入到原核生物的质粒或染 色体DNA中，利用这些生物的转录和翻译系统合成目的蛋白。原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、 药物研发等领域。
原核表达系统的应用领域
总结词
原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、药物研发等领域，用于生产重组蛋白、抗体、疫苗 等生物制品。
药物设计与筛选
蛋白质结晶研究有助于揭示蛋白质的结构与功能关系，为药物设计与筛选提供理论依据 。利用原核表达系统可以快速获得大量具有特定功能的蛋白质，为药物研发提供有力支
持。
蛋白质相互作用研究
互作蛋白的鉴定
通过原核表达系统可以获得与目标蛋白 相互作用的互作蛋白，为互作蛋白的鉴 定提供有力支持。
VS
互作机制的研究
利用原核表达系统可以深入研究蛋白质之 间的相互作用机制，揭示互作蛋白在生命 过程中的作用。
05
原核表达系统的改进 与发展
提高表达产物的产量
探索新的宿主菌
通过选择或改良宿主菌，提高表达产物的产量。例如，使用具有更 强蛋白表达能力的菌株或对现有菌株进行基因改造。
优化培养条件
通过调整培养基成分、温度、pH等条件，促进宿主菌的生长和蛋 白质的表达。
详细描述：原核表达系统的优点包括操作简便、成本低 廉、表达量高等。由于原核生物的遗传背景和生理特征 比较简单，因此在进行基因表达时不需要太过复杂的操 作。此外，原核生物具有较高的繁殖速度，可以快速地 生产大量的目的蛋白。但是，原核表达系统也存在一些 缺点，如表达产物可能存在免疫原性、翻译后修饰功能 不足等。此外，由于原核生物的转录和翻译机制与真核 生物存在差异，因此有些真核生物基因在原核表达系统 中可能无法得到理想的表达效果。
原核表达及纯化方法
原核表达及纯化-His tag一、原核表达1.挑取一个单菌落（重组表达载体），接种到10mL LB培养基中（注意抗生素抗性）。
37℃，过夜摇菌。
2.次日，将菌液接种到1L LB培养基中（1:50~1:100），继续培养至OD600=0.6时（0.6~0.8），加1×IPTG诱导4h。
（加IPTG前留样（诱导前全菌蛋白）200μL做SDS-PAGE）3.收菌：(1)200μL诱导后全菌；(2)小量表达：收集5mL诱导后全菌，12000g离心1min，裂解沉淀，分别收集上清（可溶性）和沉淀（包涵体）中的蛋白。
大量表达：收集1L诱导后全菌，4℃，4500g离心15~30min。
二、可溶性分析目的：重组蛋白是否表达，是可溶性的还是包涵体形式。
根据这个结果选择纯化方法。
（1）各用30μL 4×SDS Loading buffer重悬诱导前和诱导后的菌体（200μL）；用500μL 1×Binding Buffer重悬菌体（5mL），超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）；4℃，19000g离心15min，分离上清和沉淀；（2）用30μL 4×SDS Loading buffer重悬沉淀；（3）取10μL上清蛋白加10μL 4×SDS Loading buffer；（4）将诱导前全菌，诱导后全菌，上清蛋白和包涵体蛋白煮沸5~10min。
（5）各取10μL 用于SDS-PAGE检测（12%的胶）。
三、小量富集实验样品制备：取5mL诱导全菌，用500μL 1×Binding Buffer（8M Urea）溶解，超声破碎（3min，超2s，挺3s，27%能量；溶液透亮即可）。
4℃，19000g离心15min，取上清用于富集实验。
（留样做SDS-PAGE）富集：1.装柱：取30μL~50μL体积的Ni柱料（纯柱料）于1.5mL离心管中。
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原核表达一、原理1、E . coli 表达系统E . coli 是重要的原核表达体系。
在重组基因转化入E . coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。
2、外源基因的诱导表达提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。
常用的有温度诱导和药物诱导。
本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。
不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。
二、材料1、诱导表达材料( 1 ) LB （Luria—Bertani）)培养基酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10gNaCl 10g 琼脂(Agar) 1-2%蒸馏水(Distilled water) 1000ml pH 7.0适用范围：大肠杆菌( 2 ) IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃保存。
( 3 ) l×凝胶电泳加样缓冲液：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )50 mmol / L DTT2 % SDS （电泳级）0.1 ％溴酚蓝10 ％甘油2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料1 ）酶溶法（1）裂解缓冲液：50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )1 mmol / L EDTA100 mmol / LNaCI（2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。
（3）10 mg / mL 溶菌酶。
（4）脱氧胆酸。
（5）1 mg / mL DNase I。
2 ）超声破碎法( 1 ) TE 缓冲液。
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液：100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )100 mmol / L DTT4 %SDS0.2 ％溴酚蓝20 ％甘油三、实验方案1、外源基因的诱导表达( 1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。
( 2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。
( 3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定，确定无误后进行下一步。
( 4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，则在30 -32 ℃培养数小时，使培养液的OD600达0.4-0.6 ，迅速使温度升至42 ℃继续培养3 -5h ；如果表达载体的原核启动子为tac 等，则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。
继续培养3 -5h 。
( 5 ）取上述培养液1 mL , 1000g 离心，1 min ，沉淀，加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后，作SDS -PAGE 检测。
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化1 ）细菌的裂解常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法；④酶溶法；⑤化学渗透等。
前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。
下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
（1）酶溶法。
常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳多糖酶；糖昔酶等。
溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。
主要步骤为：① 4 ℃，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。
弃上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。
②每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱氧胆酸（在冷室中进行）。
③37 ℃，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。
室温放置至溶液不再粘稠。
（2 ）超声破碎法。
声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎，在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切，大大降低液体的粘稠度。
①收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每克湿菌加3 mLTE 缓冲液。
②按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集上清液和沉淀。
③分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2×凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS -PAGE 。
注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关，应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
2 ）包涵体的分离蛋白质在细菌中的高水平表达，常形成相差显微镜下可见到的细胞质颗粒，即为包涵体，经离心沉淀后可用Triton-X100 / EDTA 或尿素洗涤，若为获取可溶性的活性蛋白，须将洗涤过的包涵体重新溶解并进行重折叠。
（1）试剂与配制①洗涤液I：0.5 % Triton X -10010 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 )溶于细胞裂解液中。
②2×凝胶电泳加样缓冲液。
（2）细胞裂解混合物12 000g 离心，15 min , 4 ℃；弃上清，沉淀用9×洗涤液l 悬浮；室温放置5 min ;12 000g 离心15 min , 4 ℃；吸出上清，用100 μL 水重新悬浮沉淀；分别取10 μL上清和重新悬浮的沉淀，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS-PAGE 。
3 ）包涵体的溶解和复性（1）试剂与配制①缓冲液I：1 mmol / L PMSF8mol /L 尿素10 mmol / L DTT溶于前述裂解缓冲液中。
②缓冲液Ⅱ：50 mmol / L KH2PO41 mmol / L EDTA ( pH 8 . 0 )50 mmol / L NaCI2 mmol / L 还原型谷胱甘肽1 mmol / L 氧化型谷胱甘肽③KOH 和HCI 。
④2×凝胶电泳加样缓冲液。
（2）用100 μL 缓冲液I 溶解包涵体；室温放置lh ；加9×缓冲液Ⅱ，室温放置30 min ，用KOH 调pH 到10.7 ；用HCI 调至pH 8 . 0 ，在室温放置至少30 min ; 1000g 离心，15 min ，室温；吸出上清液并保留，用100 μL 2×凝胶电泳加样缓冲液溶解沉淀；取10 μL 上清，加10 μL 2× 凝胶电泳加样缓冲液，与20 μL 重新溶解的沉淀进行SDS-PAGE 。
四、注意事项（1）不同的大肠杆菌表达载体带有不同的启动子和诱导成分。
实验者必须根据特定系统和用途决定相应的实验方案。
（2）表达和检测时，应设置对照组，如转化载体和非诱导细胞。
（3）由于大肠杆菌中表达的重组蛋白质缺少哺乳动物细胞特异的翻译后加工，所以，其生物活性无法与天然蛋白质相提并论。
原核表达操作步骤及注意事项将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过pcr方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
2、测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3、以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。
（四）诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶50比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含50mlLB培养基的300ml培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组,余下的加入IPTG诱导剂至终浓度0.4mM作为实验组,两组继续37℃震荡培养3hr。
4、分别取菌体1ml, 离心12000g×30s收获沉淀，用100μl 1%SDS重悬，混匀, 70℃10min。
5、离心12000g×1min，取上清作为样品,可做SDS-PAGE等分析。
三、注意事项1、选择表达载体时，要根据所表达蛋白的最终应用考虑。
如为方便纯化，可选择融合表达；如为获得天然蛋白，可选择非融合表达。
2、融合表达时在选择外源DNA同载体分子连接反应时，对转录和转译过程中密码结构的阅读不能发生干扰。
蛋白质与多肽提取分离1 分离方法采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。
对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。
这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。