原核表达步骤
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：〔1〕选择标志的编码序列；〔2〕可控转录的启动子；〔3〕转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；〔4〕一个多限制酶切位点接头；〔5〕宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中〔测序验证〕－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备〔1〕LB培养基。
〔2〕1M IPTG〔异丙基硫代-β-D-半乳糖苷〕：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。
二、操作步骤〔一〕获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物〔在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点〕，PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA 为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
〔二〕构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶〔同引物的酶切位点〕进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验过程结果
大肠杆菌的原核表达实验一般分为以下几个步骤：
1. 构建表达载体：将待表达的基因克隆到适当的表达载体上,如常用的pET、pGEX等载体中。
2. 转化大肠杆菌：将表达载体转化到大肠杆菌细胞中。
可以通过化学方法、电转化、冷冻复苏、热激转化等方法进行。
3. 诱导表达：在大肠杆菌细胞进行生长至适当时期后,添加适宜浓度的诱导剂,如IPTG等,诱导待表达基因蛋白的合成。
4. 细胞收获和破碎：诱导一定时间后,收获大肠杆菌细胞并进行破碎,以获得待表达蛋白。
5. 蛋白提取：对细胞破碎物进行离心、超滤等步骤,去除残余细胞构成和杂质,得到含有待表达蛋白的上清液。
6. 纯化和分析：将上清液进行分离、纯化、鉴定,以确定表达蛋白相应的分子量、酶活性等。
在以上步骤中,实验者需要进行质控和评估,确认实验步骤是否正确和表达蛋白是否达到预期,以确保实验结果的可靠性和准确性。
原核表达步骤
原核表达步骤原核表达是指在原核生物体内将基因转录成RNA，再将RNA翻译成蛋白质的过程。
本文将详细介绍原核表达的步骤。
1. 转录DNA的双链结构被酶RNA聚合酶解开，从而形成mRNA链。
RNA聚合酶沿着DNA模板链移动，将mRNA链合成在一起。
在这个过程中，RNA聚合酶根据DNA模板链上的碱基序列，选择正确的核苷酸，将其加入到正在合成的mRNA链上。
2. 剪接在细胞核内，mRNA链是在原核生物上转录的。
这些mRNA链可能包含顺式调节区域（UTR）和内含子区域。
在剪接过程中，内含子被剪除，UTR被保留下来。
这个过程由小核RNA（snRNA）和蛋白质共同完成。
3. 翻译翻译是将mRNA链转化为氨基酸序列的过程。
翻译是在核糖体中完成的。
核糖体是由rRNA和蛋白质组成的复合体。
核糖体通过识别mRNA上的起始密码子来开始翻译过程。
起始密码子是AUG。
核糖体将氨基酸连接在一起，直到遇到终止密码子。
终止密码子分别是UAA，UAG和UGA。
翻译完成后，成品蛋白被释放出来。
4. 后翻译修饰在翻译完成后，蛋白质可能需要进行后翻译修饰。
这些修饰可以包括磷酸化，甲基化，硫化，酰化和糖基化等。
这些修饰可以改变蛋白质的结构和功能，从而影响其生物学活性。
5. 折叠蛋白质被合成后，需要进一步折叠成其最终形态。
这个过程由分子伴侣和蛋白酶等分子机器完成。
分子伴侣可以协助蛋白质正确地折叠。
蛋白酶可以降解不正确折叠的蛋白质，防止它们对细胞造成损害。
6. 定位在折叠完成后，蛋白质需要被定位到其最终的位置。
这个过程由信号肽和其他分子机器完成。
信号肽是一段氨基酸序列，可以将蛋白质定位到细胞膜，内质网，线粒体等亚细胞结构中。
原核表达是一个复杂的过程，包括转录，剪接，翻译，后翻译修饰，折叠和定位。
这些步骤需要各种不同的分子机器和分子信号来协同完成。
理解原核表达的步骤可以帮助我们更好地理解生物学过程，从而为生命科学的研究和应用提供基础。
原核表达详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤
5、 pET重组子鉴定
如果亚克隆成功，阳性菌落数远大于阴性菌落。
检验转化子的方法很多，包括PCR、质粒抽提及酶切分析、测序，体外转录和翻译。
若用PCR方法，可选用载体上的T7promoter （5‘载体特异性引物）and termintor（3‘特异性引物）引物中的一个和基因中的一个序列引物进行PCR验证，并可以判断插入方向。
6、DE3溶原菌的诱导表达
（1）从新鲜的划线平板中挑取单克隆到50ml含50ug/ul 卡那霉素的液体培养基中，37℃培养至OD600为0.4-1。
（2）培养基中加入100mMIPTG至终浓度为0.4mM（T7启动子）或1 mM（T7lac 启动子），继续培养2-3小时。
（3）将摇瓶置于冰上5min，5000g 4℃离心5min收集菌体。
（4）重悬细胞于0.25倍体积预冷的20mMTris-HCl （pH8.0）中，离心。
（5）除去上清，菌体保存于-70℃或继续纯化。
7、 SDS-PAGE进行目标蛋白质分析
（1）机械破碎细胞。
一般用弗氏压碎法或超声波处理。
（2）裂解液14000g离心10min，分离可溶和不溶部分。
（3）100ul可溶上清中加入100ul 4×SDS上样buffer和水。
85℃迅速加热3min 使蛋白变性，然后上样进行SDS-PAGE分析，观察蛋白表达。
（4）若目标蛋白在不溶部分中，需进行包涵体纯化。
750ul20mMTris-HCl, pH7.5重悬沉淀，离心10000g5min, 除去上清重复洗涤。
然后1.5ml 1％SDS上样buffer中重悬沉淀，重复（3）的步骤进行SDS-PAGE分析。
原核表达的详细步骤
原核表达详细步骤PartⅠ选择表达的目的基因一、基因序列1. 得到靶基因DNA（cDNA）序列，有几种方式寻找正确的读码顺序:①利用生物信息学在NCBI上blast同源基因，找到同源蛋白，再在DNA的ORF中找到正确的读码。
②实验方法，即得到蛋白，进行测序，然后在DNA上找到正确的读码。
③利用mRNA的特征，找到启动子，编码区，终止子。
在编码区中找到翻译起始密码子与终止密码子（cDNA）。
2. 注意事项：①区别ORF和CDS→ORF一般在DNA上的定义，寻找原则是翻译起始密码子和终止密码子；CDS可以是DNA上的定义，也可以是mRNA上的定义，分为complete CDS 和partial CDS,是从第一个核酸开始读，连续读下去，complete CDS读码是“M、、、、、、、、、＊”，partial CDS的读码是相应的AA②在进行试验设计时，充分利用生物信息学的信息后，在进行试验设计。
二、抗原决定簇的预测1、原理：蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。
一般抗原决定簇是由6－12 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一级结构）组成或由不连续的蛋白质三维结构组成。
变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。
只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。
做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。
2、选择原则：（1）、亲水性：大部分抗原决定簇是亲水性的。
（2）、处于结构表面：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合。
（3）、有弹性：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。
所以一般来说蛋白质的N 端及C 端是很好的抗原决定簇区域。
3、选定抗原决定簇的步骤：（1）预测：如软件预测DNAstar（Protean）预测，Dnaman。
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋⽩，然后进⾏蛋⽩纯化。
本实验⽅案的前提是，⽬的基因已克隆到载体，并已转进⼊JM109菌株中。
1．鉴定⽬的蛋⽩是否在⼤肠杆菌JM109或BL21中⼤量表达（1）制样1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加⼊0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1：50⽐例（200ul），将活化的过夜培养物加⼊10mL LB液体培养基中，加⼊10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min 摇床扩⼤培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使⼤肠杆菌处于最适合表达外源蛋⽩的⽣长状态。
(⼀般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第⼀次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩⼤培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空⽩对照（CK），其余7ml菌液加⼊7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。
以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离⼼2min收集菌体，倾倒上清，每个离⼼管收集3ml培养物。
5. 加⼊1ml dH2O，将管底沉淀⽤振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离⼼2min，倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离⼼管中的⽔倒⼲净。
（⼆）菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加⼊200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，⼀般200ul⽐较合适)。
⽤漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。
样品凉后，12000r/min离⼼3min，取每管的上清点样。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及 SDS-PAGE 分析 挑测序正确的单克隆接种到 3mLLB（50 μg·mL-1Kan）培养基中，振 荡培养 12h 后，将菌液按 1﹕100 的比例加入到 300 mL LB（50 μ g·mL-1Kan）培养基中 200 r/min 37℃振荡培养至 OD600 为 0.5 —0.6 时，加入 IPTG（使终浓度为 1 mmol·L-1）进行诱导表达， 分 别 在 37 ℃ 诱 导 4h ， 4 ℃ 保 存 备 用 。 未 加 IPTG 诱 导 的 pET-28a-CsFOMT 收集作为阴性对照。诱导全部完成后，各取 50 mL 菌液离心收集细菌，加入 SDS 上样缓冲液，悬浮混匀，100℃ 3 min， 12 000 r/min 离心 1 min，取上清 4℃保存备用。另取 50 mL 菌 液离心收集菌体后用 1×PBS （PH7.4）将沉菌悬起，经过超声波细 胞破碎（20 mm 的变幅杆，400 W，超声 2 s，间隔 5 s，重复 60 次），10 000 r/min 离心 10 min 分离上清和沉淀，上清和沉淀样 品中分别加入 SDS 上样缓冲液，混匀，沸水浴，取上清和沉淀分别 进行 SDS-PAGE（5 %浓缩胶，12%分离胶），然后分析蛋白表达结果
1. 将已经成功转有重组表达载体 pET-28a-CYP83A1 的表达菌 E. coli. BL21 (DE3)在 LB 固体培养基（50μg/mL Kan）上划线接种培 2. 挑取单菌落，接种于 5 mL 的 LB 液体培养基(50μg/mL Kan) 中，37℃，180 r/min 振荡培养过夜。 3. 取 500 μL 过夜培养的菌液转接入 100 mL 新的 LB 液体培养基 (50μ g/mL Kan) 中 ， 37 ℃ ， 190 r/min 振 荡 培 养 到 菌 液 OD 600 =0.6~0.8。 4. 分组培养：实验组加入终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG，对照组不 加 IPTG， 37℃，190 r/min 诱导培养 6 h。 5. 8000 r/min 离心 2 min，收集细菌，用 1×PBS(0.01 mol/L) 缓冲液悬浮。 6. 冰上超声波破碎，功率 30 w，工作 5 s，间歇 5 s，总时间 2 min。 7. 4℃、12 000 r/min 离心 10 min，分离上清与沉淀，取 100 μL 上清与等体积的 2×上样缓冲液混合；用 200 μL 1×上样缓 冲液悬浮沉淀，沸水浴 5 min 后，对上清和沉淀进行 SDS-PAGE 检 测。