口蹄疫O型液相阻断ELISA免疫抗体检测方法的应用_胡珊莲

2015年第1期浙江畜牧兽医欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍表3副猪嗜血杆菌西药药敏试验结果药物耐药中敏高敏抑菌圈直径环丙沙星1516－202126氧氟沙星1011－151632头孢哌酮1516－202136复方新诺明1011－151611林可霉素1415－20210诺氟沙星1516－181924青霉素1920－27280链霉素1112－14150庆大霉素1213－141521Hps 血清型较多，目前报道有15种，不同菌株对同一种抗生素的敏感性存在很大差异，临床治疗应结合分离菌株的药敏试验结果，科学用药。

3小结与讨论本试验通过对疑似发病猪场采集患猪病料，并进行病原菌分离鉴定、动物试验，鉴定为副猪嗜血杆菌。

通过药敏试验，确诊分离菌对庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢哌酮高敏，复方新诺明中敏，青霉素、链霉素、林可霉素耐药；对金银花及其组成的复方敏感，且复方作用效果优于单方［9］。

副猪嗜血杆菌病临床治疗上中药建议使用金银花及其组成复方，西药建议使用庆大霉素、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和头孢哌酮。

参考文献［1］Oliveira S ，Blackall P J ，Pijoan C．Characterization of thedi －versity of Haemophilus parasuisfield isolates by use of sero －typing and genotyping ［J ］．Am J Vet Ｒes ，2003，64（4）：435－442．［2］Del Ｒio M L ，Gutierrez C B ，Ｒodriguez Ferri E F．Value ofin －direct hemagglutination and coagglutination tests for serotyping Haemophilus parasuis ［J ］．J Clin Microbiol ，2003，41（2）：880－882．［3］蔡旭旺，刘正飞．副猪嗜血杆菌的分离培养和血清学鉴定［J ］．华中农业大学学报，2005（2）：55－58．［4］高丰，罗毅，成军，等．副猪嗜血杆菌感染的诊断与防治［J ］．动物医学进展，2002，23（6）：101－102．［5］朱小宁，余兴龙，李润成，等．副猪嗜血杆菌的分离与鉴定及其16S rＲNA 生物信息学分析［J ］．湖南农业大学学报：自然科学版，2009，35（5）：517－520．［6］易顺华，陈进喜，蒋碧桂．副猪嗜血杆菌的分离鉴定与药敏试验［J ］．动物医学进展，2009，30（9）：41－44．［7］冼琼珍，黄耿森，王淑敏，等，副猪嗜血杆菌的分离鉴定［J ］．中国兽医杂志：2006：42（3）：27－28．［8］尹秀凤，王艳，姜平，等．副猪嗜血杆菌PCＲ检测方法的建立与应用［J ］．中国兽医学报，2007，27（2）：180－183．［9］华升，梅书棋，曾德芳．副猪嗜血杆菌病研究进展［J ］．动物医学进展，2006，27（11）：7－10．收稿日期：2014-11-21口蹄疫O 型液相阻断ELISA 免疫抗体检测方法的应用胡珊莲（上海市闸北区光明荷斯坦牧业有限公司，上海闸北200436）摘要：应用液相阻断ELISA 试验方法检测上海光明荷斯坦牧业有限公司牧场牛群经口蹄疫O 型灭活疫苗免疫的奶牛血清样品2412份。

经检测，2412份样品中规模奶牛场牛群免疫抗体滴度≤1ʒ64样品42份，抗体滴度≥1ʒ128样品2370份，抗体保护率为98%。

关键词：液相阻断ELISA ；O 型口蹄疫；抗体检测；奶牛中图分类号：S858．23文献标识码：A 文章编号：1005－7307（2015）01－0003－003口蹄疫属我国农业部公布的一类动物疫病，是由口蹄疫病毒引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以牛，猪最易感，羊、骆驼、象等均有发病报告。

该病可分为O 、A 、C 、南非Ⅰ型、南非Ⅱ型、南Ⅲ型和亚洲Ⅰ型等7个血清型，其中以O型和A 型分布最广，危害最大。

本试验应用液相阻断ELISA 检测方法跟踪检测上海光明荷斯坦牧业有限公司下属牧场O 型口蹄疫疫苗免疫抗体滴度水平，以利及时指导下属牧3浙江畜牧兽医2015年第1期场O型口蹄疫防疫工作，为牧场健康发展提供有效保障。

现将检测应用情况报告如下。

1材料与方法1．1检测样品上海光明荷斯坦牧业有限公司下属牧场牛群经口蹄疫O型灭活疫苗（JYBL-2014-5-21）免疫的奶牛血清样品2412份。

1．2实验器材酶标仪、37ħ恒温温箱；5．0 50．0μL移液器、50．0 200．0μL移液器及50．0 300．0μL12道移液器；配套移液枪尖，移液槽；吸水纸；96孔平底酶标板；96孔U形底聚丙烯微量抗原抗体反应板；检测试剂盒系采用中国农科院兰州兽医研究所口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒。

1．3实验步骤1．3．1牛群免疫应用口蹄疫O型灭活疫苗按照产品说明书规定免疫剂量及免疫方法对公司下属牧场牛群接种免疫，于2免21d后采血进行免疫效果检测。

1．3．2试剂准备包被缓冲液（pH9．6）、磷酸盐－吐温缓冲液（PBST）、PBST稀释液、底物溶液按试剂盒说明书进行配制。

1．3．3包被pH9．6包被缓冲液稀释口蹄疫O型病毒兔抗血清至工作浓度（1ʒ1000），混合均匀，酶标板上每孔加入50μL，振荡，封板室温过夜，使抗体在pH9．6条件下吸附于酶标板上。

1．3．4抗原抗体反应（对照血清及待检血清）以96孔U型微量血凝板检测，以20份样品为例，需板2块，血清以倍比稀释法进行（注：空白孔为无样品加入）。

A．加PBST稀释。

A1—A10加入150μL PBST 稀释液，B1—B10，C1—C10，D1—D10，E1—E10各加入50μL PBST稀释液。

H1加入150μL PBST稀释液，H2—H10各加入50μL PBST稀释液，A12—B12各加50μL PBST稀释液。

B．加血清稀释。

在A1中加入50μL待检血清样品，混匀后取50μL加入B1，再混匀后取50μL 加入C1连续2倍稀释（从A11ʒ4倍开始稀释到E1 1ʒ64倍，A1—A10共10个样品），直至加到E1混匀，再从E1中吸取50μL弃去。

阳性血清取50μL 加入H1，混匀后取50μL加入到H2，直至加入到H10混匀，再从H10中吸取50μL弃去（从H11ʒ4倍开始稀释到H101ʒ2048倍）。

阴性血清取50μL 加入A12，混匀后取50μL加入B12，混匀后取50μL弃去。

C．加病毒抗原。

口蹄疫O型病毒抗原用PBST 稀释液稀释到工作浓度（1ʒ12，即1份病毒抗原加11份PBST），96孔U型微量血凝板中待检样品血清及阴阳性血清每孔加50μL，加入等量工作浓度的病毒抗原后，血清稀释度加倍。

E12—H12四个对照孔各加100μL稀释至工作浓度的病毒抗原。

振荡，盖膜封板，2 8ħ过夜（详见图1）。

A B C D E F G H1234567891011 121ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ81ʒ8－1ʒ4 1ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ161ʒ8 1ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ321ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ641ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ1281ʒ128+1ʒ81ʒ161ʒ321ʒ641ʒ1281ʒ2561ʒ5121ʒ10241ʒ2048病毒抗原对照图196孔U型微量血凝板10份血清加入工作浓度病毒抗原后的浓度表1．3．5洗酶标板及抗原抗体转移先将2块抗原抗体反应板从4ħ中取出室温放置，用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从反应板上按次序转移至酶标板上的对应孔，每孔加50μL，封板，37ħ温育60min（详见图2）。

1．3．6洗酶标板及加豚鼠抗血清用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，用豚鼠抗血清稀释液将口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清稀释至工作浓度（1ʒ1000），每孔加50μL，封板，37ħ温育60min。

42015年第1期浙江畜牧兽医A B C D E F G H123456789101112 S11ʒ16S2S3S4S5S6S7S8S9S10+1ʒ16－1ʒ4 S11ʒ321ʒ32－1ʒ8 S11ʒ641ʒ64空白S41ʒ1281ʒ128空白S111ʒ16S12S13S14S15S16S17S18S19S201ʒ256S111ʒ321ʒ512S111ʒ641ʒ1024S111ʒ1281ʒ2048病毒抗原对照图296孔酶标板检测20份样品布局图1．3．7洗酶标板及加辣根过氧化物酶用PBST 稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，用PBST 稀释液将兔抗豚鼠IgG—辣根过氧化物酶结合物稀释至工作浓度（1ʒ500），每孔加50μL，封板，37ħ温育60min。

1．3．8洗酶标板及加底物溶液用PBST稀释液连续洗酶标板4次，吸水纸上甩干，加50μL底物溶液（底物溶液每1mL加10μL3%双氧水），封板，37ħ温育15min。

1．3．9加终止液15min后，每孔加50μL终止液终止反应，在酶标仪上读取D492nm值。

1．4实验结果判定1．4．1实验认可标准每板设4孔病毒抗原对照，病毒抗原对照不加任何血清，直接用PBST稀释至使用浓度，与血清/病毒抗原复合物同步加入ELISA板孔，50．0μL/孔，病毒抗原对照D492nm值应在1．5ʃ0．5范围内。

阳性对照抗体效价应在（1ʒ1024）ʃ1滴度内，阴性对照血清抗体效价应＜1ʒ8。

病毒抗原对照平均D492nm值50．00%计算（临界值），抗原对照4孔，弃去最高和最低D492nm OD值，计算剩余2孔的平均D492nm值，除2，即50．00%对照值。

该值即为临界值，表示阻断50．00%反应的对照D492nm值。

1．4．2结果判定标准以病毒抗原对照平均D492 nm值的50．00%为临界值，被检血清稀释孔D492 nm值＞临界值的孔为阴性孔，≤临界值的孔为阳性孔，阳性孔的D492nm值=临界值时所对应的稀释度为该份血清的抗体滴度。

2结果与分析2．1病毒抗原对照D492nm值2412份检测血清样品，共采用121个ELISA板，484个病毒抗原对照D492nm值在1．1 2．0范围内。

2．2阴、阳性对照血清抗体效价121个牛群检测血清样品ELISA板临界值均在对应板阳性对照血清1ʒ1024ʃ1滴度的D492nm值内，121个阴性对照血清样品1ʒ8处滴度的D492nm值均≥相应板的临界值相。