免疫学检测技术的基本原理

第二十二章 免疫学检测技术的基本原理
第一节 体外抗原抗体结合反应的 特点及影响因素
（一）抗原抗体反应的特点 1. 高度特异性 2. 表面化学基团之间的可逆结合 3. 适宜的抗原抗体浓度和比例 4. 抗原抗体反应的两个阶段
1. 高度特异性 抗原表位与抗体分子的超变区互补结合 抗体检测抗原： 抗伤寒杆菌的抗体：测伤寒杆菌 抗原检测抗体： 乙肝病毒：检测乙肝病毒抗体
（二）抗原抗体反应的影响因素 1. 电解质 2. 温度 3. 酸碱度
1. 电解质：离子强度
在适当浓度的电解质中：抗原抗体易结 合为肉眼可见的凝聚物或沉淀物。 实验中常用0.85%的NaCl等离子溶液作 稀释液。
2. 温度 体温或稍高于体温 37º C是抗原抗体反应的最适温度。一般常 使用反应在37º C水浴或孵育箱中进行。 3. 酸碱度 最适酸碱度：pH 6-8
2. 表面化学集团之间的可逆结合
抗原抗体之间：非共价键结合 结合不稳定，易受温度、酸碱度和离子 强度的影响。
3. 适宜的抗原抗体浓度和比例
抗原或抗体过剩，形成的IC复合物体 积小，数量少，肉眼不可见； 抗原抗体浓度和比例适当：IC复合物 体积大，数量多，肉眼可见。
4. 抗原抗体反应的两个阶段
第一阶段：数秒至数分，形成小的IC； 第二阶段：数分、数小时至数日，形成 较大IC复合物。
第二节 检测抗原和抗体的 体外实验（体液免疫检测）
血清学试验：抗原和其相应的抗体在体外相遇可发生特异
性结合，用已知的抗体（或抗原）检测未知的抗原（或抗 体），用于疾病的诊断。因为实验所采用的抗体常存在于血 清或体液中（关节液、脑脊液、胸水及腹水），将体外的抗 原-抗体反应称为血清学反应。
1. 2. 3. 4.
(3) 放射免疫测定法(radioimmunoassay, RIA)
(4) 化学发光免疫技术 (5) 免疫胶体金技术 (6) 免疫印迹技术(Western blotting)
SDS-PAGE
通常采用不连续电泳
系统，通过电荷效应，浓
缩效应和分子筛效应，达
到蛋白质高分辨率的分离
效果。
SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，可使蛋白质的
因为颜色反应的深浅与相应的抗体或抗原量成正比， 所以可以借助于颜色反应的深浅来定量抗体或抗原。
ELISA 检测抗体
洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相
抗原或抗体结合的物质以及在反应过程
中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。
(2) 免疫荧光技术(immunofluorescence technique) 常用荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC) 藻红蛋白(PE) 1) 直接荧光法 2) 间接荧光法
ELISA法是目前广泛应用于临床检测和生物 制药等领域的免疫学技术，具有微量、特异、 高效、经济、方便和安全等特点。 ELISA法将抗原和抗体的免疫反应和酶的 催化反应相结合，具有特异性而且极为敏感， 可以在细胞或亚细胞水平上检测抗原或抗体所 在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行 定量。

结合物和相应的抗体或抗原反应后， 结合在免疫复合物上的酶在遇到相应 的底物时，可催化底物水解、氧化或 还原，从而产生有色物质。
2. 沉淀反应：毒素、组织浸液及血清中的蛋白 等可溶性抗原与相应抗体反应后，出现肉眼 可见的沉淀物。 液相：环状、絮状沉淀反应，比浊法（检测 血浆蛋白、IgG、M、A和补体） 半固相：单向、双向琼脂扩散、免疫电泳
3. 免疫标记技术：是将抗原抗体反应与标记技 术相结合，检测抗原或抗体的一类试验方法。 将已知的抗体或抗原标记上示踪物质，通过 检测标记物间接测定抗体或抗原的量。 常用标记物：酶、荧光素、放射性核素、胶 体金、化学发光物等。 定性、精确定量、定位
凝集反应 沉淀反应 免疫标记技术 蛋白质芯片技术
1. 凝集反应 细菌、细胞等颗粒性抗原或表面包被抗 原的颗粒状物质与相应的抗体在电解质存在 的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象。 （1）直接凝集反应 （2）间接凝集反应
（1）直接凝集反应：颗粒性抗原直接与相应的 抗体反应出现的凝集现象，如红细胞的凝 集（ABO血型）、细菌凝集。 玻片法：定性，ABO血型、菌种鉴定 试管法：半定量，检测Ab的效价 （2）间接凝集反应：将可溶性抗原或抗体先吸 附在某些颗粒载体上，然后与相应抗体或 抗原进行反应产生的凝集现象。 类风湿因子检测：人变性IgG（抗原）吸附于 乳胶颗粒，检测待检血清中的RF。
二、 免疫细胞功能的测定 1. T细胞功能测定 2. B细胞功能测定
(2) 加等 量NS
(1) 抗凝 静脉血
(3) 混匀后，缓 慢加于分离液上
(4) 密度梯度离心
血浆 PBMC 分离液 PMN RBC
1. T细胞功能测定 （1）T细胞增殖试验 1）形态计数法：T细胞受到有丝分裂原刺 激，出现体积增大、细胞形态不规则、胞质 增多、细胞核松散并出现多个核仁等形态变 化。 2）3H-TdR掺入法 3）MTT法
（1）免疫酶测定法：是一种用酶标记一抗或 二抗检测特异性抗原或抗体的方法。
常用标记酶：辣根过氧化物酶（HRP）， 碱性磷酸酶(ALP)
酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)： (1)双抗体夹心法(sandwich ELISA) (2)间接ELISA 免疫组织化学技术(immunohistochemistry technique):对组织抗原进行定位、定性、定 量的检测技术。酶、化学发光、荧光技术。
氢键和疏水健打开，与之形成蛋白质－SDS复合物。由于SDS带有负 电荷，消除了不同蛋白质间原有的电荷差异，使蛋白质分子在凝胶 中的迁移率主要取决于它的分子量。
4. 蛋白质芯片技术
快速、准确、高通量的检测技术
第三节 免疫细胞功能的检测 （细胞免疫检测）
一、 免疫细胞的分离 葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法
淋巴细胞转化试验（形态学示意图）

原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体， T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转 化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂 的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。