蛋白质测定的主要原理、方法及三聚氰胺的检测方法
三聚氰胺检测方法
三聚氰胺检测方法三聚氰胺（Melamine）是一种有机化合物，常用于合成树脂、塑料和樹脂胶合板等产品。
然而，三聚氰胺被发现存在食品中，由于其高氮含量，有些不法商家为了提高奶粉等食品的蛋白质含量，将三聚氰胺掺入产品中，导致大量食品安全问题。
为了及时准确地检测食品中的三聚氰胺，许多研究机构和实验室开发了各种检测和分析方法。
本文将介绍几种常见的三聚氰胺检测方法。
一、高效液相色谱法（High-performance liquid chromatography，HPLC）高效液相色谱法是目前最常用的三聚氰胺检测方法之一、该方法基于样品中三聚氰胺在流动相（溶剂）中的溶解度和与固相（填料）相互作用，通过分离并检测样品中的三聚氰胺。
使用该方法，可以快速、准确地检测食品中的三聚氰胺含量，并得到可靠的结果。
然而，由于设备和试剂的成本较高，需要专业的技术人员进行操作和维护，因此在实际应用中可能存在一定的限制。
二、质谱法（Mass Spectrometry，MS）质谱法是通过将样品中的三聚氰胺分解成离子，并通过质谱仪测定离子的质荷比，来分析和检测样品中的三聚氰胺。
该方法具有高灵敏度、高选择性和准确度的优点。
质谱法可以与液相色谱法（LC-MS）或气相色谱法（GC-MS）等技术相结合，提高检测效果和检测速度。
质谱法需要高精密度的设备和样品处理步骤，因此需要专业的技术人员进行操作。
三、免疫学分析方法免疫学分析方法是利用抗体和抗原之间的特异性结合来检测三聚氰胺。
通过将样品中的三聚氰胺与抗体结合，然后使用标记有酶、放射性同位素或其他检测物质的二抗来检测特异性结合的抗原-抗体复合物，从而达到检测三聚氰胺的目的。
该方法具有简单、快速和灵敏的优点，被广泛应用于三聚氰胺检测，特别适合大批量样品的筛查。
然而，免疫学分析方法也存在一定的局限性，例如可能受到其他物质的干扰，准确性和特异性可能较低。
除了上述常见的方法外，还有一些新型的三聚氰胺检测方法，如表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy，SERS）、纳米材料的应用、电化学法等。
饲料中真蛋白检测
蛋白质的检测方法多于17种。
目前主流、常用的蛋白质检测方法有三种：凯氏定氮法、杜马斯燃烧法等，这些方法均有不同标准予以支撑。
然而2008年，三聚氰胺事件的爆发，使现行的蛋白质检测方法多被诟病。
主要原因是凯氏定氮法和杜马斯燃烧法主要是检测氮元素的含量，然后乘以一定的系数，测算蛋白质的含量。
这种方法计算结果是粗蛋白的含量，不能排除非蛋白氮物质的影响，造成蛋白质含量虚高。
然而由于其低成本，以及检测方法成熟等特点，仍在被广泛使用。
GB/T6432-1994饲料中粗蛋白测定方法
原理：样品消解转化成氨气被吸收，然后滴定测定出总氮元素含量，最后转化成蛋白质含量。
GB/T24318-2009杜马斯燃烧法
原理：样品经完全燃烧后转变为氮气，后经测定出总氮含量后转化为蛋白质含量。
GB/T18868-2002近红外测定法
原理：利用样品中蛋白质组分的特征红外吸收强度来测定蛋白质含量。
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蛋白质含量的测定方法及原理
蛋白质含量的测定方法及原理蛋白质是生物体内重要的基础结构和功能分子，其含量的测定对于生物学和医学研究具有重要意义。
目前常用的蛋白质含量测定方法主要包括生物化学法、生物物理法和免疫学法等。
下面将对这几种方法的原理进行详细介绍。
1. 生物化学法：生物化学法通过酶促反应或化学反应，将蛋白质转化成可以测定的可溶物或在一定条件下呈现特定吸光度的产物，从而测定蛋白质的含量。
常用的生物化学法有Lowry法、Bradford法和BCA法。
(1) Lowry法：Lowry法是1969年由Lowry等人开发的一种蛋白质定量方法。
该方法利用蛋白质与Folin-Ciocalteu试剂在碱性条件下发生氧化反应，生成具有最大吸收峰的蓝色产物，通过测定产物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。
(2) Bradford法：Bradford法是Bradford于1976年提出的一种测定蛋白质含量的方法。
该方法基于蛋白质与染料(Coomassie Brilliant Blue G-250)之间的特异结合，蛋白质和染料形成一个蛋白质-染料复合物，该复合物的吸光度变化与蛋白质的浓度呈正相关。
通过测定复合物的光密度与一系列标准溶液进行比较，来确定蛋白质的含量。
(3) BCA法：BCA法是一种在碱性条件下，将蛋白质还原成具有强吸收的蓝色离子的方法。
BCA试剂(含有琥珀酸铜II配合物和增强剂)能与蛋白质中的酸性氨基酸残基(尤其是含有两个以上连续胺基的肽键)发生氧化还原反应，生成具有强吸收的蓝色离子。
利用光密度测定产生的蓝色离子与一系列标准溶液进行比较，即可确定蛋白质的含量。
2. 生物物理法：生物物理法是通过光学原理，利用蛋白质溶液对光的吸收、散射或旋光等性质进行测定，来间接推算蛋白质的含量。
常用的生物物理法有紫外吸收光谱法、比色法和荧光法等。
(1) 紫外吸收光谱法：紫外吸收光谱法是通过蛋白质在紫外光区域的吸收特性来测定蛋白质的含量。
三聚氰胺检测方法
创新点
• 目前测定三聚氰胺 的方法已有高效液相法和气相-质谱法， 目前也有液相色谱-质谱法的报道。这些方法，存在试验需要衍 生、操 作繁琐、过程冗长、试剂用量较大及灵敏度低等缺 点。 本研究中采用萃取柱净化，离子色谱-电导法 和离子色谱-紫外法 分别检测化肥中阴离子和三聚 氰胺的含量，无需衍生，操作简单， 一次进样即可测 试多种离子，方法实用可靠，可满足化肥生产和 使用 安全检测的需要
流程
• 2.1色谱条件 离子色谱-电导检测器测阴离子 条件：SH-AP-1 阴离子色 谱柱（250 mm×4.0 mm）为 亲水性阴离子色谱柱；淋洗液为淋洗液 发生器产生 的高纯氢氧化钾溶液，梯度洗脱及浓度见表 1，流量 0.8 mL/min，进样量 25 μL，柱温和检测器池温均为 35 ℃，SHY-6型抑制 器，抑制电流 120 mA，系统压力 10.2 MPa。以保留时间定性，峰面 积定量。
特点
• (1）高压。检测中流动相由于是液体，经过色谱柱阻力较大。为了可 以顺利通过色谱柱，对载液要高压处理。
• （2）高效。实施分离过程的高效能。可以采用固定相与流 动相以保 证分离效果处于最佳，分离效能可以提高出许多倍。
• （3）高灵敏度。采用紫外检测器的应用，精度达到了0.01ng, 检测中 进样量可以达到μL数量级的精度。
• 4.2 提取溶液 对于 3 份加入了 1.0μg/g 三聚氰胺的样品依次用高氯酸 0.2mol/L（A 方法）、三氯乙酸 1%+乙腈（B 方法）、三氯乙酸 1% （依据标准 GB/T22388－2008）提取。根据三种试验结果表明， 回收 率依次为 71.5%，64.7% 和 99.3%。实验提取溶液使用 1% 三氯乙酸。
称取 7 g 三氯乙 酸，用超纯水定
三聚氰胺检测原理
三聚氰胺检测原理三聚氰胺（Melamine）是一种常用的化工原料，也被用作合成树脂和涂料的原料。
然而，由于其含氮量高、稳定性好和成本低廉的特点，三聚氰胺也被不法商家添加到食品中，以提高蛋白含量的假象，从而导致了一系列严重的食品安全问题。
因此，对食品中三聚氰胺的检测显得尤为重要。
三聚氰胺的检测原理主要是基于其与过氧化氢酶的催化反应。
过氧化氢酶是一种氧化酶，它能够催化过氧化氢的分解，生成氧气和水。
而三聚氰胺在碱性条件下与过氧化氢酶发生反应，生成氰尿酸和氨气。
通过检测氨气的生成量，就可以间接地确定样品中三聚氰胺的含量。
具体的检测步骤如下，首先，将待检样品与碱性溶液混合，使得样品中的三聚氰胺转化为氰尿酸和氨气。
然后，将过氧化氢酶加入混合液中，启动反应。
在反应过程中，氨气的产生量与样品中三聚氰胺的含量成正比。
最后，通过氨气传感器或其他相关仪器，测定氨气的含量，从而计算出样品中三聚氰胺的含量。
三聚氰胺检测原理的关键在于通过化学反应将三聚氰胺转化为氨气，从而间接地测定其含量。
这种方法不仅简单、快速，而且灵敏度高，可以满足对三聚氰胺含量的准确测定需求。
在实际的食品安全监测中，三聚氰胺的检测原理被广泛应用。
通过建立标准曲线，可以准确地测定食品样品中的三聚氰胺含量，从而保障食品安全。
此外，该方法还可以应用于其他领域，如环境监测和医药领域，具有广泛的应用前景。
总的来说，三聚氰胺的检测原理是基于其与过氧化氢酶的催化反应，通过测定氨气的产生量来间接测定样品中三聚氰胺的含量。
这种方法简单、快速、灵敏度高，被广泛应用于食品安全监测和其他领域。
通过对三聚氰胺检测原理的深入了解，可以更好地保障食品安全，维护人民群众的身体健康。
三聚氰胺的检测方法ppt课件
为了规范事业单位聘用关系，建立和 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
4. 洗板：孔内液体甩干，每孔加洗涤液250µl，洗涤4-5次， 最后用吸水纸拍干；
5. 显色：加显色液A、B各50µl，混匀，盖板避光反应10min; 6. 测定：加终止液50µl，混匀，在酶标仪450nm读OD值。 7. 结果判定：标准品、样品输入软件计算
一、概要
• 三聚氰胺（Melamine）简称三胺，是一种三嗪类含氮杂环有机化合 物，被用作化工原料。它是白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水、对 身体有害，不可用于食品加工或食品添加物。长期或反复大量摄入对 肾与膀胱产生影响，导致产生结石。
• 检测方法：①气相色谱质谱法（GC-MS） ②液相色谱串联质谱法（LC-MS-MS） ③高效液相色谱法(HPLC) 准确；成本高、操作复杂 ④ELISA——试剂盒检测 完善适 应社会 主义市 场经济 体制的 事业单 位工作 人员聘 用制度 ，保障 用人单 位和职 工的合 法权益
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四、注意事项
1. 试剂盒选用不同，操作过程不同，请按购买试剂盒 说明操作；
2. 室温低于20℃或试剂及样本未回到室温20-25℃， 会导致OD偏低；
3. 每加一种试剂前要将其摇匀； 4. 不同批号试剂盒不要混用；
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三聚氰胺的检测技术一
● 以目标物测定浓度为横坐标，目标物与对应同位素内标峰面积比为纵坐标，绘制三聚氰胺标准曲 线，在2.5～100.0 ng/mL线性关系良好，回归方程为y=0.998 266x+0.041 23，相关系数r为 0.999 3，符合检验对标准曲线的要求。
回收率实验
● 分别向空白样本中添加标准工作液、同位素内标工作液，按照1.3.1步骤处理并检测。添加水平为 0.01 mg/kg、0.03 mg/kg、0.10 mg/kg 3个水平，每个浓度6份平行样本，检测结果见表2。方 法回收率为82.8%～102.3%，相对标准偏差为3.2%～5.6%，回收率和精密度良好，符合检测方 法要求，适合液体乳中三聚氰胺的检测
● 检出限测定以空白牛奶样品为基质，一个阳性添加浓度C(10.0µg/g)，按照上述优化过的方法来 前处理和上机，所得信噪比S/N=19.49，可计算检出限为0.001 5µg/g。计算公式如下
● 检出限(method detection limit,MDL)(μg/g)=3C/(S/N)
● 回收率和精密度的确定以空白牛奶作为基质，进行相应的加标回收试验，加标浓度为 10µg/kg、 5 0 µg / k g 、 2 0 0 µg / k g 。 每 个 加 标 浓 度 分 别 做 6 个 相 同 浓 度 的 平 行 试 样
结论
● 本研究探索优化了一种基于高效液相色谱-串联质谱法的内标法测定液态奶 中三聚氰胺的分析方法。该方法通过用含10%二乙胺的乙腈水溶液充分提 取，取上清液进行氮吹浓缩后，定容上机测定，最后，该方法的检出限达 到了0.001 5μg/g，能灵敏的检测低含量基质，同时，液态奶试样在按 10μg/kg、50μg/kg、200μg/kg 3个浓度添加情况下根据该试验方法进行 前处理和仪器检测，结果回收率为87.79%～104.54%，相对标准偏差为 2.39%～5.07%。该方法具有前处理简单便捷、检出结果精密度高定量结 果准确且重复测试较为稳定等特点，大大提高了液态奶中三聚氰胺的检测 效率，方便对此类药物的监督管控对有效的倒逼生产养殖端按规定使用该 类药物起到积极推动作用
三聚氰胺检测原理
三聚氰胺检测原理
三聚氰胺是一种有机化合物，其检测原理主要是基于其与蛋白质的相互作用。
在三聚氰胺检测中，常用的方法包括光谱法、色谱法、质谱法等。
其中，光谱法是最常用的一种方法，其原理是利用三聚氰胺与蛋白质形成的复合物在特定波长下吸收光线的特性来进行检测。
在光谱法中，常用的检测方法包括紫外-可见光谱法和荧光光谱法。
紫外-可见光谱法是利用三聚氰胺与蛋白质复合物在特定波长下吸收光线的特性来进行检测，通过测定吸光度的变化来确定三聚氰胺的含量。
而荧光光谱法则是利用三聚氰胺与蛋白质复合物的荧光特性来进行检测，通过测定荧光强度的变化来确定三聚氰胺的含量。
除了光谱法外，色谱法也是一种常用的三聚氰胺检测方法。
色谱法主要包括气相色谱法和液相色谱法两种。
气相色谱法是将样品中的三聚氰胺通过气相色谱柱进行分离，再通过检测器进行检测，从而确定其含量。
而液相色谱法则是将样品中的三聚氰胺通过液相色谱柱进行分离，再通过检测器进行检测，从而确定其含量。
此外，质谱法也是一种高灵敏度的三聚氰胺检测方法。
质谱法是将样品中的三聚氰胺通过质谱仪进行分析，通过测定其分子离子的质荷比来确定其含量。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率和高准确性的特点，是目前三聚氰胺检测中较为常用的方法之一。
综上所述，三聚氰胺的检测原理主要是基于其与蛋白质的相互作用。
常用的检测方法包括光谱法、色谱法和质谱法。
不同的方法具有各自的特点和适用范围，可以根据实际情况选择合适的方法进行检测。
希望本文能够对三聚氰胺检测原理有所了解，有助于相关领域的研究和实践工作。
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蛋白质测定的主要原理、方法及三聚氰胺的检测方法蛋白质是复杂的含氮有机化合物，相对分子质量很大，大部分高达数百万，它们由20中氨基酸通过酰胺键以一定的方式结合起来，所含的主要化学元素为C、H、O、N，在某些蛋白质中含微量的P、Cu、Fe、I等元素。
不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同，故各种蛋白质的含氮量也不同。
根据蛋白质的性质和成分，测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质的含量；另一种是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团等测定蛋白质含量。
目前常用的有四种经典方法，即凯氏定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。
另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）。
其中考马斯亮蓝法（Bradford 法）法和Folin－酚试剂法（Lowry法）法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10～20倍，比双缩尿法（Biuret法）法灵敏100倍以上。
定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
一、常量凯氏定氮法1.原理：（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在酸性溶液中。
（2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点330℃，而添加硫酸钾后，温度可达400℃，加速了整个反应过程。
此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点。
其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加。
加速了有机的分解。
但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失。
为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂。
但为了防止污染通常使用硫酸铜。
所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂。
（3）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出。
（4）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量。
半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。
2.操作步骤：准确称取样品中0.50-2.00g→于500ml凯氏瓶中→加10g无水K2SO4→加0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化30分钟→至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加200ml水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在凯氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至到凯氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用0.1N HCl滴定。
3.计算：总氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W × 100二、双缩脲法（Biuret法）1.原理：脲小心加热至150~160 摄氏度时，两个分子的脲脱去一个氨分子生成双缩尿，可于铜离子形成有色复合物，成为双缩脲反应。
蛋白质分子中含有两个以上的肽键，与双缩脲的结构相似，也由双缩脲反应（而氨基酸中没有此结构），因此，在碱性溶液中蛋白质与二价铜离子（如硫酸铜）形成可溶性的紫色复合物（在540~560nm波长范围有最大吸收），在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质含量成正比，而与蛋白质的分子质量及氨基酸成分无关。
2.操作步骤：试剂：（1）甘油作为稳定剂：取10ml10N KOH溶液，3.0ml甘油加到937ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO450ml。
（2）酒石酸钠作稳定剂，吸10ml10N KOH溶液和20ml25%酒石酸钾钠溶液加到930ml水中，激烈搅拌，同时加入4%CuSO4液40ml。
配制以上两种溶液、试剂，必须澄清，无氢氧化铜生成，否则重配。
标准曲线绘制：以采用凯氏定氮法测出蛋白质含量的样品作为标准蛋白质。
按蛋白质含量40、50、60、70、80、90、100和110mg分别称取混合均匀的标准蛋白质样与8支50ml 纳氏比色管中，然后各加入1ml四氯化碳，然后再用试剂（1）或（2）准确稀释至50ml，振摇10分钟，静置1小时，取上层清液离心5分钟，取；离心5分钟，取离心分离后的透明液与比色皿中，在560nm波长下一蒸馏水作参比液调节仪器零点并测定个溶液的吸光度，以蛋白质的含量为从坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线。
样品的测定：准确称取样品适量（即使得蛋白质含量在40~110mg之间）于50ml纳氏比色管中，加入1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测定其吸光度。
用所测得的吸光度在标准曲线上即可查得蛋白质mg数，进而求得蛋白质含量。
3.计算X=(m1*100)/m式中：X为蛋白质的含量（mg/100g）m1为由标准曲线上查得的蛋白质毫克数（mg）m为样品质量（g）三、Folin－酚试剂法（Lowry法）1.原理：这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。
此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。
这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。
‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。
在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。
对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。
而且对后者的影响还要大得多。
酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。
浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。
含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。
若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
2.操作步骤：试剂：试剂甲：（A） 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O）。
溶解于500毫升蒸馏水中。
（B） 0.5克硫酸铜（CuSO4•5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4•2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4•2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。
稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为250 mg/ml左右。
牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9 % NaCl溶液。
（1）标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。
用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（20～25℃）放置10分钟。
再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。
这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。
然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。
以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。
全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。
待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。
每分钟测一个样品。
（2）样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。
通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。
即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。
如上表中的8、9、10试管根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意：由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。
因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
四、紫外吸收法1. 280nm的光吸收法因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收，且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度值A280。
蛋白质浓度可控制在0.1~1.0mg/ml左右。
通常用1cm光径的标准石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。
由此可立即计算出蛋白质的大致浓度。
许多蛋白质在一定浓度和一定波长下的光吸收值（A1％1cm）有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算蛋白质浓度。
下式列出了蛋白质浓度与（A1％1cm）值（即蛋白质溶液浓度为1%，光径为1cm时的光吸收值）的关系。