第3节液相色谱的固定相与流动相
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经典液相色谱法
（六）定性与定量分析
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
四、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量旳液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附旳水
✓ 流动相：与水不互溶旳有机溶剂（饱和正丁醇）
✓ 分离机制：同液-液分配色谱
✓ 定性参数：
Rf
1
1 K VS
原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离
L1 L2
✓ 讨论
• 参照物与被测组分在完全相同条件下展开 能够消除系统误差，大大提升重现性和可靠性；
• 参照物能够是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参照物性质及色谱条件有关，
范围能够不小于或不不小于1
（三）吸附剂旳选择 根据被测物极性和吸附剂旳吸附能力
图示
图示
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
设R’为单位时间内一个分子在展开剂中出现的几率
设1 R’为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率
定时展开保留比 R' uR L1 t L1 u0 L0 t L0
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
(R' 1)
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
合用：分析酸性或中性物质
续前
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
定性分析——日光，紫外光，显色 定量分析——洗脱法，薄层扫描法
四、纸色谱法
将固定相放在纸上，以纸做载体进行点样、展开、 定性、和定量旳液-液分配色谱法
✓ 固定相：纸纤维吸附旳水
✓ 流动相：与水不互溶旳有机溶剂（饱和正丁醇）
✓ 分离机制：同液-液分配色谱
✓ 定性参数：
Rf
1
1 K VS
原点到组分斑点质量中心的距离 原点到参考物斑点质量中心的距离
L1 L2
✓ 讨论
• 参照物与被测组分在完全相同条件下展开 能够消除系统误差，大大提升重现性和可靠性；
• 参照物能够是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Rs与组分、参照物性质及色谱条件有关，
范围能够不小于或不不小于1
（三）吸附剂旳选择 根据被测物极性和吸附剂旳吸附能力
图示
图示
L0 L2
L1
（二）定性参数
1. 比移值Rf
设R’为单位时间内一个分子在展开剂中出现的几率
设1 R’为单位时间内一个分子在固定相中出现的几率
定时展开保留比 R' uR L1 t L1 u0 L0 t L0
Rf
原点到组分斑点质量中心的距离
原点到溶剂前沿的距离
L1 L0
(R' 1)
2）吸水→失活 →105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大 →500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力
合用：分析酸性或中性物质
续前
2. 氧化铝
碱性氧化铝 pH 9～10 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4～5 适于分析酸性、中性物质
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
天然药物化学第二章,第三节,色谱分离
薄层色谱的操作技术流程
铺
板
点
样
展
开
计算比移值
显色与定位
二、吸附色谱法
（五）操作技术 1.薄层色谱法 步骤：制板→点样→展开→显色→Rf值计算
43
操作步骤
（1）软板的制备
软板：直接将吸附剂(我们有哪些吸咐剂）铺在玻璃板上制 成，不加粘合剂 要求：厚度→随分离要求而定，一般0.25～0.5mm 玻璃棒推动速度不宜过快、也不应停顿→影响厚度均一性
5
植物色素分离图示
一、分离原理和基本概念：
色谱法： 是利用混合物中各成分在 流动相和固定相之间的 作用力和亲和力（吸附， 分配，离子交换、分子 筛）的不同，在两相中 作相对移动时，混合物 中各种成分随流动相运 动速度不同，从而达到 相互分离的方法。
7
8
色谱分离
慢 中等 快
淋洗液
Temporal course
适用范围
酸性成分：氨基酸、有机酸； 对酸稳定的中性成分 生物碱、甾体、强心苷
备注
不适用：醛、 酮、酯、内酯 类成分
中性成分：醛、酮、皂苷、萜 中性 6.5~7.5 类
★
27
常用吸附剂
2.硅胶（应用最多★） 吸附能力决定于硅羟基数，吸附活性取决于含水量。
OH Si O O Si O O O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O Si O O O OH Si O Si O O O OH Si O Si O O O
炭。
二、吸附色谱法
（二）吸附剂（固定相） 选择合适的吸附剂是吸附色谱法成功的关键。★ 良好的吸附剂应具备： ①不与样品及流动相发生化学反应 ②不溶于流动相 ③具有较大的表面积和一定的吸附能力。 ④具有一定的细度，颗粒要均匀。
固定相与流动相
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮>二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫 化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
2018/10/20
4. 选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱 子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并 在柱中沉积。 （4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测 器时，流动相不应有紫外吸收。
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4. 空间排阻分离固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响 小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
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５. 手性固定相
生物、药物分子和天然有机 产物的分离。 环糊精（CD） 结构：
液相色谱的固定相与流动相
不同流动相的特点
有机溶剂
常用的流动相之一，适用于分 离非极性化合物。
水
常用于分离极性化合物，具有 良好的溶解性。
缓冲溶液
用于调节样品的酸碱度，对某 些化合物有选择性。
如何选择合适的固定相和流动相
1 样品特性
根据样品的性质选择合适 的固定相。
2 分离需求
根据对目标化合物的选择 性需求，选择合适的流动 相。
液相色谱的固定相与流动 相
液相色谱是一种重要的分析技术，其中固定相扮演着关键的角色。
固定相介绍
液相色谱中的固定相是一种材料，通常填充在色谱柱中。 固定相可以根据其化学性质和粒径大小进行选择。
流动相介绍
流动相是在液相色谱过程中对样品进行携带的溶剂。 流动相的选择会影响分离的选择性和分辨率。
液相色谱的工作原理
液相色谱通过固定相和流动相之间的相互作用将样品分离。 不同组分在固定相上的相互作用力不同，导致不同程度的保留和分离。
不同固定相的特点
反相色谱柱
常用于分离非极性化合物，具有较强的保留和分离能力。
离子交换色谱柱
适用于分离带电离子化合物，具有良好的选择性。
大小排除色谱柱
可分离不同分子大小的化合物，常用于生物分析。
3 分析目的
根据分析的目的和需要， 综合考虑选择合适的固定 相和流动相。
案例分析
例如，当分析复杂的生物样品时，可以使用离子交换色谱柱和缓冲溶液作为流动相，以实现对带电离子的有效 分离。 根据需要，还可以选择具有不同化学性质的固定相，以进一步提高分离效果。
液相色谱的固定相与流动相
不同固定相的选择与优势
C18
适用于中极性非极性化合物，适用于医药化 学等领域。
手性
可以实现大量手性化合物的分离，广泛应用 于制药、医药等领域。
芳香族
由于分子间的π-π堆积作坊，固定相表面可 以容纳一定分子体积。主要用于分离芳香族 或含芳香族结构物质。
离子交换
适用于分离具有离子性的化合物和混合物。
常见的流动相
液相色谱的固定相与流动 相
液相色谱（Liquid Chromatography）是一种高效、分辨率较高、适用于大多 数分子的分离技术。本文将介绍液相色谱的固定相和流动相。
固定相的介绍
作用
固定相是固定在色谱柱中的一种材料。它的 主要作用是提供一个分离的平台。
种类
常见的固定相有C18、C8、芳香族、离子交 换、手性等，不同的固定相分离作用不一样。
选择因素
在选择固定相时需要考虑分离物的化学性质 和分子结构，以及分离柱的长度和直径等。
优势
固定相具有高分离效率、高分离分辨率、操 作简单、时间短、试剂消耗小等优点。
流动相的 按一定比例调配而成。
种类
常见的流动相种类有水、有机 溶剂、盐酸等，不同种类的流 动相适用于不同的分离柱。
3 环境领域
4 化工领域
适用于环境污染物分析、有机化合物测定、 微量元素测定等。
分离和纯化有机化学品、研究石油化工原 料和煤化学反应机理等。
总结与展望
液相色谱是一种高效、分辨率较高的分离技术，应用领域较广。未来液相色谱技术将更好地结合质谱， 等离子体及纳米技术，应用的领域将更加广泛和深入。
作用
流动相可以作为分离物在色谱 柱中移动的载体，通过改变流 动相的性质，对分离物产生分 离作用。
高效液相色谱固定相和流动相
高压液相色谱HPLC培训教程(六)IV．固定相和流动相在色谱分析中，如何选择最佳的色谱条件以实现最理想分离，是色谱工作者的重要工作，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。
本章着重讨论填料基质、化学键合固定相和流动相的性质及其选择。
一、基质（担体）HPLC填料可以是陶瓷性质的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。
无机物基质主要是硅胶和氧化铝。
无机物基质刚性大，在溶剂中不容易膨胀。
有机聚合物基质主要有交联苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。
有机聚合物基质刚性小、易压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最终使柱效降低。
1．基质的种类1）硅胶硅胶是HPLC填料中最普遍的基质。
除具有高强度外，还提供一个表面，可以通过成熟的硅烷化技术键合上各种配基，制成反相、离子交换、疏水作用、亲水作用或分子排阻色谱用填料。
硅胶基质填料适用于广泛的极性和非极性溶剂。
缺点是在碱性水溶性流动相中不稳定。
通常，硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2~8。
硅胶的主要性能参数有：①平均粒度及其分布。
②平均孔径及其分布。
与比表面积成反比。
③比表面积。
在液固吸附色谱法中，硅胶的比表面积越大，溶质的k值越大。
④含碳量及表面覆盖度（率）。
在反相色谱法中，含碳量越大，溶质的k值越大。
⑤含水量及表面活性。
在液固吸附色谱法中，硅胶的含水量越小，其表面硅醇基的活性越强，对溶质的吸附作用越大。
⑥端基封尾。
在反相色谱法中，主要影响碱性化合物的峰形。
⑦几何形状。
硅胶可分为无定形全多孔硅胶和球形全多孔硅胶，前者价格较便宜，缺点是涡流扩散项及柱渗透性差；后者无此缺点。
⑧硅胶纯度。
对称柱填料使用高纯度硅胶，柱效高，寿命长，碱性成份不拖尾。
2）氧化铝具有与硅胶相同的良好物理性质，也能耐较大的pH范围。
它也是刚性的，不会在溶剂中收缩或膨胀。
但与硅胶不同的是，氧化铝键合相在水性流动相中不稳定。
不过现在已经出现了在水相中稳定的氧化铝键合相，并显示出优秀的pH稳定性。
2.高效液相色谱仪和固定相、流动相
光电二极管阵列检测器
3. 差示折光检测器（differential refractive index detector） 除紫外检测器之外应用最多的检测器；
可连续检测参比池和样品池中溶液的折光 指数差值。差值与浓度呈正比；
特点：
通用型检测器 ; 灵敏度低（10-7g.mL-1），不能用于痕量分 析; 对温度敏感，要求使用温度恒定; 对流动相流量变化敏感，不能用于梯度洗脱。
六、液相色谱法流动相
1. 流动相特性 2. （1）流动相的种类、配比可显著改变组
分分离状况； 3. （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相
， 称为正相液液色谱法; 4. （3）流动相的极性大于固定液的极性，
则称为反相液液色谱 。
组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。
2. 流动相类别 按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗
外梯度: 两台高压泵， 将两种不同极性的溶剂 按一定的比例送入梯度 混合室，混合后进入色 谱柱。
内梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两 种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高 压泵中混合。
讨论1
用ODS柱分析一有机弱酸混合物样品， 以某一比例甲醇-水为流动相时，样品容 量因子较小，若想使容量因子增加，较 好的办法是 A 增加流动相中甲醇的比例 B增加流动相中水的比例 C流动相中加入少量HAc D流动相中加入少量的氨水
高压泵按其性质可分为恒压泵、恒流泵两类
1）往复式柱塞泵： 恒流 泵； 易于更换溶剂，适用于梯 度洗脱但有脉冲波动，可 以加一阻尼器抑制脉冲。
2）气动放大泵： 恒压泵 液缸体积大，更换流动相 不方便，不便于梯度洗脱， 无脉冲、稳定流量的输出, 现多用于装柱。
液相色谱基本原理
液相色谱基本原理
液相色谱（Liquid Chromatography，简称LC）是一种基于溶
液流动性的分离技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
其基本原理是将待分析的混合物通过溶液流动，并在固定相上进行分离。
液相色谱的基本原理包括以下几个方面：
1. 手段：液体作为流动相，传递溶解后的待测物进入色谱柱中。
2. 色谱柱：色谱柱是液相色谱的核心部件，通常由一根加有固定相（Stationary Phase）的管道组成。
固定相的选择取决于待
分离物质的性质，如极性、分子大小等。
3. 固定相：液相色谱中的固定相可以是脂肪、硅胶、酸性树脂等。
固定相的选择应根据待测物质的极性、溶解性等特点。
4. 流动相：流动相在液相色谱中起到溶解、输送待测物质的作用。
流动相可以是无机溶液、有机溶剂或其混合物。
5. 分离机理：在液相色谱中，样品分离主要通过样品分子在固定相表面上与流动相的相互作用来实现。
不同成分在固定相上的相互作用力量差异较大，从而导致它们在色谱柱中以不同速度移动。
6. 检测器：液相色谱的检测器用于检测分离出的各个组分，并将其转化为电信号进行记录和分析。
常用的检测器包括紫外-
可见吸收检测器、荧光检测器、电子喷雾检测器等。
液相色谱的基本原理是基于分子之间的相互作用力差异实现物质的分离。
通过调整流动相的成分、固定相的性质或改变操作条件等，可以实现对不同成分的定量分离和分析。
液相色谱具有灵敏度高、分析速度快、选择性好和适用性广等特点，成为许多实验室和工业界的常用分析技术之一。
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8/1/2020
一、液相色谱固定相
stationary phases of LC
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采
用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见； 现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体） 30 ～ 40μm 的 玻 璃 微 球 ，
第三节 固定相与流动相
stationary phase and mobile phase
第四节 影响分离的因素与操作条件选择
factors influenced separation and choice of operation condition
第五节 离子色谱法
ion chromatograph
树脂类别： （1） 阳离子交换树脂（强酸 性、弱酸性） （2） 阴离子交换树脂（强碱 性、弱碱性）
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4. 空间排阻分离固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构； 水为流动相。适用于常压排阻分离。
（2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶； 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂
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2.液-固吸附分离固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm；
8/1/2020
3.离子交换色谱分离固定相
结构类别： （1）薄壳型离子交换树脂
薄壳玻璃珠为担体，表 面涂约1%的离子交换树脂； （2）离子交换键合固定相
薄壳键合型；微粒硅胶 键合型（键合离子交换基团）
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
8/1/2020
请选择内容
第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
第二节 基本原理与主要分离类型
basic principle and main separating types
8/1/2020
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；
耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （5）有利于梯度洗脱；
存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；
第六节 超临界流体色谱
supercritical fluid chromatograph
结束
8/1/2020
第三章 液相色谱分析
high performance ห้องสมุดไป่ตู้iquid chromatograph
第三节 液相色谱的固定相与
流动相
stationary phase and mobile phase of HPLC
一、液相色谱固定相
stationary phase of HPLC
二、液相色谱流动相
mobile phase of HPLC
（3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等； 化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响
小，可在较高流速下使用。 可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
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二、液相色谱的流动相
mobile phases of LC
1. 流动相特性
（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动 相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；
表面附着一层厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
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（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. 硅氮键型： ≡Si—N
8/1/2020
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂， 若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。 也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使 保留时间缩短。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳> 环己烷>己烷>煤油(最小)
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4. 选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定 相等。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极 性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正 相柱。
（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液 液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上 的出峰顺序相反。
8/1/2020
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇 、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动 相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。