支原体检测SOP
支原体培养基的灵敏度检测SOP
1. 目的建立支原体灵敏度检测操作规程，保证检测结果的真实可靠。
2. 范围用于自制支原体培养基和外购支原体培养基灵敏度的检测。
3. 职责3.1.质量管理部：负责本规程的起草。
3.2. 质量管理部检验人员：负责本规程的操作。
3.3. 总经理：负责本规程的审批。
4. 定义5. 引用标准无。
6. 材料6.1. 所需材料6.1.1. 菌种：肺炎支原体（ATCC 15531）、口腔支原体（ATCC 23714）购自北京中原公司。
6.1.2. 培养基:6.1.2.1 支原肉汤培养基猪胃消化液 500ml 氯化钠 2.5g牛肉浸出液（1：2） 500ml 葡萄糖 5.0g酵母浸粉 5.0g 酚红 0.02g6.1.2.2 支原体半流体培养基按6.1.2.1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂2.5～3.0g。
6.1.2.3 支原体琼脂培养基按6.1.2.1项处方配制，培养基中不加酚红，加入琼脂13.0～15.0g。
6.2. 仪器设备无6.3. 器械、用具6.3.1 灭菌玻璃移液管7. 流程图无8. 内容8.1.变色单位试验法：将菌种接种于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传2代后。
将培养物接种到待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种到支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内，每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。
8.2. 结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。
8.3. 液体培养基的灵敏度肺炎支原体（ATCC 15531）应达到10-3，口腔支原体（ATCC 23714）应达到10-4。
9. 注意事项无10. 附录及派生记录无11. 相关文件无12. 修订记录。
支原体培养法检查SOP (1)
1.1规范支原体培养法检查的检验操作程序，确保检验结果的准确有效。
2. 适用范围：2.1本标准规定了本公司支原体培养法检查的SOP。
2.2本标准适用于本公司支原体培养法检验。
3. 职责：3.1 检验人员：严格按照本SOP进行检定，并完成与本SOP相关的记录。
3.2检定组长：按照本SOP组织相关人员进行培训，并监督实施。
3.3质量控制室主任：负责对本SOP的实施进行管理。
4. 材料：4.1供试品：主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞、病毒收获液、原液、牛血清。
4.2 器具：1ml、10ml刻度移液管，180℃干热灭菌2小时。
4.3 仪器：电炉，超净工作台/生物安全柜，37℃生化培养箱4.4 检定用培养基：支原体肉汤培养基（由培养基室提供），支原体半流体培养基（由培养基室提供），精氨酸支原体肉汤培养基（由培养基室提供），精氨酸支原体半流体培养基（由培养基室提供），上述培养基灵敏度应符合要求。
已检定合格血清。
5. 内容：5.1 操作步骤：5.1.1 先将半流体培养基煮沸10～15分钟，然后冷却至56℃左右，再加入新生牛血清（培养基∶血清为8∶2），充分摇匀。
肉汤培养基无需煮沸，但使用前需要按照上述方法添加新生牛血清。
5.1.2 取2种支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支（已冷却至36℃±1℃），每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。
5.1.3 于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行次代培养，每一支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察一次。
5.2 结果判定：培养结束时，接种供试品的培养基均无支原体生长，则判供试品合格；如疑有支原体生长，取加倍量供试品复试，如无支原体生长，判供试品合格，如有支原体生长（液体培养基中呈极浅淡均匀浑浊，半流体培养基中呈小彗星状或沙粒状），则判供试品6.健康、安全与环境：6.1所有用过的培养基应灭菌后再废弃。
支原体培养检验操作程序
支原体培养检验操作程序一、接收标本：标本与检验单查对正确，标本质量合格。
二、标本处理：接种Uu、Mh培养药敏一体试剂盒：操作前将所需试剂取出置室温30分钟。
1、A排第一孔加入培养液100μL作为阴性对照；2、将标本拭子直接放入培养液中充分振荡并在瓶壁挤干拭子，若为男性尿液取离心沉淀物150μL或阳性标本取50μL于培养液中混匀。
3、将混有标本的培养液各100μL 加入A排余下及B排各孔中；4、各孔加矿物油覆盖，置于37℃温箱培养。
第24、48小时分别观察记录结果。
结果判断原理：培养基含有相应支原体生长所需的蛋白质、马血清、生长因子、底物及酚红指示剂，当有支原体生长时，底物被分解，使PH值升高，培养基由橙黄色变成红色，且清亮为阳性。
培养基不变色为阴性。
B1孔阳性为解脲支原体阳性；B2孔阳性为人型支原体阳性。
药敏孔A排为高浓度，B排为低浓度，变红则耐药，不变红示敏感而不生长。
当高浓度与低浓度两孔均不生长(不变色)为该药敏感；高浓度不变色低浓度变红为该药物中介；高浓度与低浓度均变红为该药物耐药。
结果一：第24小时B1孔由橙黄色变成红色示解脲支原体阳性，药敏看结果判断；第24小时、48小时观察B2孔均不变色，示无人型支原体生长或浓度极低，报告培养出解脲支原体，未培养出人型支原体。
结果二：第24小时B1孔不变色示解脲支原体阴性；第48小时观察B2孔由橙黄色变成红色示人型支原体阳性，药敏看结果判断。
报告未培养出解脲支原体，培养出人型支原体附药敏结果。
结果三：第24小时B1孔由橙黄色变成红色示解脲支原体阳性，药敏看结果判断；第48小时观察B2孔由橙黄色变成红色示人型支原体阳性，药敏看结果判断，报告培养出解脲支原体与人型支原体附药敏结果。
结果四：阳性对照孔由橙黄色变成红色示支原体阳性，药敏看结果判断；第24小时、48小时观察B1孔、B2孔均不变色，示无解脲、人型支原体生长或浓度极低，报告培养出非解脲、人型支原体或嘱病人重留标本复查。
支原体检验标准操作规程记录
支原体检验标准操作规程记录
支原体是一种细菌，可以引起一些疾病，例如支原体肺炎。
支原体检验通常是通过采集患者的呼吸道分泌物样本进行检测。
下面是支原体检验的标准操作规程记录：
1. 样本采集，首先，医务人员需向患者解释采集支原体样本的过程，并确保患者理解并同意。
然后，使用标本采集棒从患者的咽部或鼻腔采集分泌物样本。
确保采集的样本足够用于后续的检测。
2. 样本保存和运输，采集完样本后，将其置于适当的容器中，并尽快送往实验室进行检测。
在运输过程中，需要确保样本的稳定性和完整性，避免样本污染或损坏。
3. 样本检测，实验室技术人员根据标准操作规程，使用适当的检测方法对支原体样本进行检测。
常见的检测方法包括PCR（聚合酶链反应）和培养法。
在检测过程中，需要严格遵守操作规程，确保结果的准确性和可靠性。
4. 结果记录和报告，一旦检测完成，实验室应当及时记录检测结果，并按照相关规定向医务人员报告。
检测结果应当包括阳性或
阴性的判定，以及可能的数量或浓度信息。
5. 结果解读和处理，医务人员在收到检测结果后，应当结合患
者的临床症状和其他检查结果进行综合分析和判断。
根据检测结果，及时采取相应的治疗措施，并告知患者相关信息。
以上是支原体检验的标准操作规程记录，这些步骤和规程的严
格执行对于确保支原体检验的准确性和可靠性非常重要。
希望这些
信息能够对你有所帮助。
资料：MycoAlert试剂盒检测支原体污染 SOP,2012
中美冠科生物技术有限公司1目的规范MycoAlert试剂盒检测支原体污染实验操作。
2职责采用MycoAlert试剂盒检测支原体污染的实验人员需执行此SOP。
3适用范围3.1 Cell bank建库细胞每批冻存前都需取样进行支原体检测。
（不要复苏检查冻存质量时再送样，避免传代麻烦。
）3.2 Cell support每次供给细胞前取样检测。
冻存任何一批细胞前都必须取样检测。
平时有时间追踪已检测阳性的细胞，若阴性，则及时扩大冻存。
3.3Cell-based assay已知支原体情况、培养时间短（3周内）、又不需回冻的细胞，可以不检测。
未知支原体污染情况的，需取样检测。
3.4 Primary cell culture符合取样条件的，立即取样送检。
不要等冻存时再取样。
因为早发现，早隔离，尽量避免交叉污染。
3.5Cell selling复苏的细胞为支原体阴性的批次，因几天后就售出。
就视为阴性，不检测。
若复苏的细胞，不知道支原体污染情况，则售出前取样检测。
（无论客户要求检测支原体）4内容/流程4.1 主要材料MycoAlert Mycoplasma Detection Kit, LT07, Lonza.微孔板分光光度计4.2 步骤4.2.1样品准备待测样品的准备：将细胞在无抗生素的培养液中传代两次，使其汇合率达到90-100%，并且三天之内（如11月4日换液，11月7日可以取样）不更换培养液。
这样的细胞培养液在无菌条件下用无菌离心管收集上清液。
阳性对照样品的准备：将已知支原体阳性的细胞，在无抗生素的培养液中传代两次，使其汇合率达到90-100%，且三天之内不更换培养液。
取培养物上清，离心，分装，-20℃保存。
4.2.2 试剂准备准备MycoAlert试剂（LT07-318）a. 向标有LT27-216的试剂瓶加入10ml McoAlert缓冲液b. 盖上白色的盖子，轻柔的混匀，c. 室温静置15分钟配制MycoAlert底物a. 向标有LT27-224的试剂瓶加入10ml McoAlert缓冲液b. 盖上绿色的盖子，轻柔的混匀，c. 室温静置15分钟d. MycoAlert试剂和MycoAlert底物分装冻存于-20度，6个月内使用。
支原体(培养法)检测程序
1.目的指导并规范直接培养法检测小牛血清支原体的操作。
2.适用范围本程序包括初次接种培养、第7天转种培养、结果判定标准及培养基的最终处理。
适用于小牛血清支原体直接培养法检查的全过程。
3.职责3.1 质控部负责本程序的起草3.2 总经理负责本程序的审批3.3 质控检验人员负责本程序的操作4.定义5.引用标准《中华人民共和国药典》四部 2015版6.材料及设备6.1 试剂6.1.1 供试品小牛血清，8ml以上6.1.3 效期内灭活小牛血清，使用前确认批号、有效期，并填写相应记录。
6.1.4 阴性对照：无菌生理盐水（安瓿瓶2ml/瓶）10ml6.2 培养基6.2.1 效期内支原体肉汤培养基8ml /支（中管），4支（初种）和8支（转种）。
记录批号及有效期。
6.2.2 效期内支原体半流体培养基8ml /支（中管），4支（初种）和8支（复种）。
记录批号及有效期。
6.3 用具1ml刻度吸管、10ml 刻度吸管。
清洗、灭菌参《玻璃器皿的清洗灭菌程序》6.4 设备6.4.1 生物安全柜。
6.4.2 35～37℃孵箱。
6.4.3 电磁炉6.5 其它6.5.1 无菌医疗用品无菌帽、无菌口罩和橡胶检查手套。
记录批号。
6.5.2 75%酒精棉，参见《75%酒精棉配制程序》SXRS-SOP 02-1-0-70。
记录批号。
7.流程图无8.内容8.1 初次接种和培养观察8.1.1 操作前准备——支原体半流体培养基融化：8.1.1.1 将支原体半流体培养基放入不锈钢锅内。
8.1.1.2 用电磁炉加热10～15分钟，使其完全融解。
8.1.1.3 冷却至触摸不烫手8.1.1.4 供试品、培养基、小牛血清、灭菌物品、75%酒精棉、记号笔、试管架放在操作间。
8.1.1.5 标记培养基：用记号笔在支原体肉汤培养基和支原体半流体培养基中管外壁注明阴性对照和供试品名称、批号、接种日期。
8.1.1.6 补加灭活小牛血清：8.1.1.6.1 用75%酒精棉擦拭小牛血清瓶。
肺炎支原体检测的SOP内容
HQBJS/MYXM-9-2015 SOP文件B9.1【检验目的】肺炎支原体是人类原发性支原体肺炎的病原体，经呼吸道感染。
多发生于儿童、青年，发病初期临床症状不明显，隐性感染和轻型感染较多，也可致严重肺炎，出现头痛、发热、咳嗽等，本试验用胶体金法定性检测人血清中的肺炎支原体IgM 抗体。
B9.2【检验原理】用肺炎支原体抗原固相硝酸纤维素膜，应用渗滤式间接法原理，检测血清中肺炎支原体抗体。
B9.3【样本要求】血清样品不能溶血，应为新鲜血清或2℃～8℃条件保存不超过3天。
高脂血症血清不能使用。
B9.4【样本采集】不抗凝血2ml，避免溶血、混浊、或脂血标本B9.5【试剂盒主要组成成份】斑点反应板：40块（或20块）试剂A： 1瓶, 约10ml试剂B: 1瓶,约8ml, 胶体金标记物B9.6【储存条件及有效期】产品应储存在2℃～8℃条件中，不能冷冻；有效期8个月。
HQBJS/MYXM-9-2015 SOP文件B9.7【检验方法】滴入二滴试剂A于反应板中央孔中，待完全渗入；滴入100µl血清于反应板孔中，待完全渗入；滴加三滴试剂B于反应板孔中，待完全渗入；渗入三滴试剂A于反应板孔中，待完全渗入。
B9.8【结果解释】阳性：反应板孔中出现红色圆斑和清晰的红色质控线，为肺炎支原体抗体阳性；阴性：反应板孔中只显现清晰的红色质控线，为肺炎支原体抗体阴性；失效: 反应板孔中未显现红色质控线，为操作失误或试剂失效。
B9.9【检验方法的局限性】本试剂试验仅用于检测肺炎支原体抗体而非直接检测肺炎支原体，因而阳性结果并不能确诊是肺炎支原体感染。
对患者状况的诊断应结合患者临床体征与症状和试验结果的综合分析。
抗体含量低的血清样品，不能被检测出来是可能的。
部份肺炎支原体感染的患者，不产生抗体或产生少量的抗体。
此时，可能显示阴性结果。
试验结果可疑时，应用培养基进行培养确诊。
HQBJS/MYXM-9-2015 SOP文件B9.10【产品性能指标】批内精密度：阳性符合率和阴性符合率均应≥95%，反应斑点颜色深浅程度应接近。
支原体检测操作规程
支原体检测操作规程
首先，支原体检测操作规程通常包括以下内容：
1. 样本采集，根据不同的病情和病人的具体情况，支原体检测通常需要采集相应的生物样本，比如咽拭子、尿液或生殖道分泌物等。
操作规程会详细说明如何正确采集样本，以确保样本的准确性和完整性。
2. 样本保存和运输，操作规程会规定样本的保存方法和运输要求，包括保存温度、保存时间和运输条件等，以确保样本在检测前的质量和完整性。
3. 实验室操作，操作规程会详细说明实验室人员在进行支原体检测时应该遵循的操作步骤，包括样本处理、试剂使用和设备操作等，以确保检测结果的准确性和可靠性。
4. 质控要求，操作规程通常还会包括质控要求，包括内部质控和外部质控的要求，以确保实验室的检测结果符合质量标准。
其次，支原体检测操作规程的制定和执行对于医疗机构和实验
室来说非常重要。
遵循规程可以保证检测结果的准确性和可靠性，
有助于医务人员正确判断病情并采取相应的治疗措施，从而保障患
者的健康和安全。
此外，支原体检测操作规程的执行也需要严格遵守相关的法律
法规和标准，比如医疗器械管理条例和实验室质量管理规范等。
医
务人员在执行操作规程时需要严格按照规定的步骤和要求进行操作，确保检测过程的合法性和规范性。
总的来说，支原体检测操作规程是保障支原体检测质量和结果
准确性的重要保障措施。
医务人员应该严格遵守规程，确保检测过
程的科学性和规范性，从而为患者的诊断和治疗提供可靠的实验室
支持。
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支原体检测SOP
目的：制定支原体检验标准操作规程，确保检验操作正确。
范围：本标准适用于本公司主细胞库、工作细胞库、病毒种子批、对照细胞、病毒收获液、原液的支原体检验操作。
依据：《中国药典》2010年版三部通则3301支原体检测法。
一、培养法
1、检测原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
2、适用器材：灭菌锅、试管（带盖）、10ml移液管、1ml移液管、37℃培养箱、
3、检测步骤：
（1）培养基的制备：【外购培养基】
（2）检测培养基的灵敏度：
将菌种接于适宜的支原体培养基中，经36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10-7～10-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10-3～10-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。
每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7～14天，观察培养基变色结果。
结果判定以接种后培养基管数的2/3以上呈现变色的最高稀释度为该培养基的灵敏度。
液体培养基的灵敏度：肺炎支原体（ATCC 15531株）应达到10-8，口腔支原体（ATCC 23714株）应达到10-4。
（3）培养基前处理：
检查支原体采用支原体液体培养基和支原体半流体培养基（或支原体琼脂培养基）。
半流体培养基（或琼脂培养基）在使用前应煮沸10～15分钟，冷却至56℃左右，然后加入灭能小牛血清（培养基︰血清为8︰2），并可酌情加入适量青霉素，充分摇匀。
液体培养基除无需煮沸外，使用前亦应同样补加上述成分。
（4）接种培养：
取每支装量为10ml的支原体液体培养基各4支、相应的支原体半流体培养基各2支（已冷却至36℃±1℃），每支培养基接种供试品0.5～1.0ml，置36℃±1℃培养21天。
于接种后的第7天从4支支原体液体培养基中各取2支进行代次培养，每支培养基分别转种至相应的支原体半流体培养基及支原体液体培养基各2支，置36℃±1℃培养21天，每隔3天观察1次。
（5）结果判定：
无生长——合格；
疑有生长——加倍量复试——无生长——合格；
二、DNA染色法
1、检测原理：利用荧光染剂（Hoechst 33258）侦测支原体污染。
染剂和支原体DNA 特异性结合，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，证明细胞被支原体污染。
2、适用器材：二氧化碳培养箱、荧光显微镜、6孔培养板（含盖玻片）、灭菌锅、1ml、10ml移液管、无菌载玻片、
3、检测步骤：
（1）检测试剂的制备：
A、无菌HBSS：配制Hanks’ balanced salt solution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。
勿用高压蒸汽灭菌。
B、.Hoechst 33258 stock solution（100X）：称取5.0 mg bisbenzimide于100 ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。
C、.Hoechst 33258 working reagent：取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。
D、.封片液（mounting solution）：22.2 ml 0.1 0.1ml/L 枸橼酸和27.8 ml 0.2mol/L 磷酸氢二钠加入于50 ml 甘油中混合，以11mol/L NaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。
E、.固定溶液（fixative）：冰醋酸与甲醇以1：3体积比例混合，使用前才配制。
（2）培养基和指示细胞：
DMEM完全培养基
DMEM无抗生素培养基
指示细胞：
.培养Vero细胞：（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。
测试前一周培养Vero细胞。
在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以105cells／ml培养于6孔细胞培养板中，每个孔加入0.5ml细胞悬浮液，每空再加无抗生素培养基3ml，于37℃, 5％CO2培养。
隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。
（3）供试品处理：
细胞培养物将供试品经无抗生素培养液至少传一代，然后取细胞已长满的且3天未换液的细胞培养上清液待检。
毒种悬液如该毒种对指示细胞可形成病变并影响结果判定时，应用对支原体无抑制作用的特异抗血清中和病毒后或用不产生细胞病变的另一种指示细胞进行检查。
其他供试品检查时所选用的指示细胞应为该供试品对其生长无影响的细胞。
（4）DNA染色
于制备好的指示细胞培养板中加入供试品（细胞培养上清液）2ml（毒种或其他供试品至少1ml），置5%二氧化碳孵箱36℃±1℃培养3～5天。
指示细胞培养物至少传代1次，末代传代培养用含盖玻片的6孔培养板培养3～5天。
①吸除培养液，于每个孔中加入5ml 1：3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10 min后，吸除固定液。
重复上述之步骤，风干10分钟。
②于每个孔中，加入5ml Hoechst 33258 working solution，,加盖，室温下静置30min。
③吸掉Hoechst 33258染液后，以5ml无菌水洗涤3次，吸出水后，盖玻片于空气中干燥，取洁净载玻片加封片液1滴，分别将盖玻片面向下盖在封片液上制成封片。
④荧光显微镜观察。
观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或是丝状点之荧光物产生。
用无抗生素培养基2ml替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
用已知阳性的供试品标准菌株2ml替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
（5）结果判定
阴性对照—无生长（荧光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。
）
阳性对照—生长（在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色荧光小点或是丝状点。
其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。
）
供试品—阴性—合格
供试品—阳性—重试—阳性—不合格。