Sanger法测定季节性H3N2亚型流感病毒全基因组序列重点
湖北省2007~2012年 H3N2流感病毒 HA基因及抗原性分析
湖北省2007~2012年 H3N2流感病毒 HA基因及抗原性分析梁杨;霍细香;方斌;刘琳琳;陈盛杰;刘准;陈丹【期刊名称】《华中科技大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(45)3【摘要】目的：研究湖北省2007~2012年 H3N2流感病毒 HA 基因变异及抗原性变化情况。
方法选取2007~2012年分离的湖北省各地区 H3N2流感病毒39株,提取病毒 RNA,运用 RT-PCR技术扩增 HA基因并测定序列,软件导出其核苷酸、氨基酸序列,采用MEGA5.2构建进化树,用红细胞凝集抑制实验检测病毒的抗原性。
结果14株毒株红细胞凝集抑制结果显示效价与参照抗原有4倍以上的差异,提示H3N2流感病毒存在抗原性变异；核苷酸有较高的同源性,为97%~99%；HA1区共有50个氨基酸发生改变,其中37个在抗原位点,受体结合位点有2个(194、225位),抗原决定簇 A区4个,B区6个,C区2个,D、E区各1个；糖基化位点有明显的地域差异,不同地区糖基化位点的数量和位置均不相同。
结论湖北省2007~2012年间 H3N2流感病毒抗原性和 HA基因存在变异。
%Objective To investigate the variation of HA gene and antigenicity of influenza H3N2 viruses in Hubei province during 2007-2012.Methods RNA was extracted from 39 strains of influenza H3N2 viruses obtained from different areas in Hubei province during 2007-2012.The HA gene was amplified with RT-PCR and sequenced.The amino acid and nucleotide sequences were obtained by using the software.Then the evolutionary tree was constructed via MEGA 5.2.The antigenicity of the strains was determined by hemagglutinationinhibition(HI)test.Results HI test results showed that there was a difference of more than 4 times in the antibody titer between the samples and the standard antigen,suggesting the antigenic variation of H3N2 flu viruses.The nucleotide homology was high,and reached 97%-99%.Fifty amino acids changed in the HA1 segment, including 37 in antigen sites,2 in receptor binding sites(194,225),4 in the antigenic determinant area A,6 in area B,2 in area C and 1 in area D and E each.There were significant differences in the number and position of glycosylation sites between different regions.Conclusion There were variations in HA gene and antigenicity in H3N2 virus in Hubei province during 2007-2012.【总页数】6页(P292-297)【作者】梁杨;霍细香;方斌;刘琳琳;陈盛杰;刘准;陈丹【作者单位】武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 430065; 湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079;武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 430065;武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉430065;武汉科技大学医学院公共卫生学院，武汉 430065【正文语种】中文【中图分类】R181.36【相关文献】1.H3N2亚型猪流感病毒HA基因序列测定及抗原性分析 [J], 刘大飞;杨涛;刘明;刘春国;桑学波;刘大程2.一株野鸟源H3N2亚型禽流感病毒HA基因序列分析 [J], 李知新;吴润;马龙;赵燕;李杰;宋权儒3.2007-2017年中国甲型H3N2流感病毒HA基因特征分析 [J], 徐姿;柯美霞;崔大伟;王胜军4.2019-2020年山东省H3N2流感病毒抗原性及血凝素基因特征分析 [J], 吴巨龙;吕健;寇增强;宋绍霞;孙林;何玉洁;刘倜5.2007～2008年流感监测季北京地区H3N2亚型流感病毒抗原性与HA1基因特性分析 [J], 石伟先;王晓梅;梁慧洁;吕燕宁;彭晓旻;丁立新;段玮;杨鹏;张家淮;黄芳;王全意;庞星火因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立
H3N2亚型猪流感病毒实时荧光定量PCR快速检测方法的建立陈艳;张春明;乔传玲;杨焕良;张飞;吴运谱;辛晓光;陈化兰【期刊名称】《中国兽医科学》【年(卷),期】2009(39)10【摘要】根据H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)基因保守序列,分别设计并合成了特异性引物和TaqMan MGB探针,利用实时荧光定量PCR技术检测SIV。
使用含有选定检测序列的重组质粒pMD18-H3HA、pMD18-N2NA标准品绘制标准曲线,其相关系数分别为0.99015(H3HA)和0.99947(N2NA)。
检测结果显示,该方法的敏感性可达100 copies/μL,除H3N2亚型SIV外,对H1亚型、H9亚型SIV以及猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪瘟病毒、猪生殖与呼吸综合征病毒和猪2型圆环病毒的检测均为阴性,应用该方法对实验室感染样品进行检测,其结果与病毒分离结果的符合率为95.83%。
表明,该方法特异性强、重复性好,有望成为H3N2亚型SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法。
【总页数】6页(P894-899)【关键词】猪流感病毒;H3N2亚型;Taq;Man;MGB探针;实时荧光定量PCR【作者】陈艳;张春明;乔传玲;杨焕良;张飞;吴运谱;辛晓光;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室农业部动物流感重点开放实验室【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.H3N2亚型禽流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 刘婷婷;谢芝勋;宋德贵;谢志勤;邓显文;谢丽基;黄莉;罗思思;黄娇玲2.分子信标荧光定量PCR检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立 [J], 禹思宇;周宇;唐连飞;孟芳;袁晓芬;梁斌3.H1、H3亚型猪流感病毒双重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 王博;王慧煜;赵宝华;罗静;王承民;何宏轩;韩雪清4.H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 刘好朋;胡京京;唐续;裴仉福;李冰;李琳;陈瑞爱;贺东生5.H3亚型猪流感病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 郭泗虎;王文华;张亮权;齐海涛;曹楠;闫明菲;黄昌力;张超轶;张桂红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析
人源H3N2亚型猪流感重组病毒的分离鉴定及全基因序列分析周伦江;王隆柏;俞玉鸿;魏宏;车勇良;陈如敬;吴学敏;邵良平;庄向生【摘要】A virus was isolated from the pig tissue sample of swine influenza-like case and identified as a H3N2 swine influenza virus (SIV) by HA and HI test, designated A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2). The virus titers were 10-4.8 ELD50, and 10-6.17 EID50 in inoculated chicken embryos. The results of sequence analysis indicated that the virus nucleotide sequences shared 84.7% to 98.1%, 94.4% to 99.5%, 88.6% to 97.6% with HA, NS, NA gene of human influenza virus (HIV) reference strains, respectively, and 87.7% to 98.5%, 82.5% to 99.9%, 87.6% to 98.4% with SIV reference strains, respectively. Homology of M gene was less than 90.1% with SIV H3N2 strains and HIV strains, but shared more than 97.6% with SIV H1N1 strains. These results indicated that the PB2, PB1, PA, HA, NP, NA and NS gene of A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2) isolate might originate from the H3N2 subtype HFVs which were isolated from 1975 to 1982, and M gene might originate from the H1N1 subtype SIV, indicating that the isolate was a human-swine influenza reassortant virus with the RNA segments from human H3N2 influenza virus and classicalH1N1 SIV.%本研究由疑似猪流感病料样品中分离一株病毒,通过HA、HI、电镜观察、生物学特性测定及全基因序列测定表明,分离病毒株为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型古典猪流感病毒(SIV)的重组体,命名为A/Swine/Fujian/F2/07(H3N2).该分离株含有8个基因片段,共13 442 bp,与GenBank中登录的H3N2亚型人流感病毒、H1N1亚型古典SIV和H3N2亚型SIV进行比较分析显示:分离株的HA、NS、NA基因与H3N2亚型人流感病毒株的同源性分别为84.7 ％～98.1％、94.4 ％～99.5％和88.6 ％～97.6％；与H3N2亚型SIV的核苷酸同源性分别为87.7％～98.5％、82.5 ％～99.9％和87.6 ％～98.4％；M基因与H3N2亚型人流感病毒和SIV的同源性均在90.1％以下,而与H1N1亚型古典SIV的同源性在97.6％以上.基因型分析表明分离株的PB2、PBI、PA、HA、NP、NA和NS基因片段来源于1975年～1982年的人流感病毒,而M基因来源于H1N1亚型古典SIV,充分证明猪作为流感病毒“混合器”的作用.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)009【总页数】6页(P675-680)【关键词】两源重组H3N2亚型;分离;序列分析【作者】周伦江;王隆柏;俞玉鸿;魏宏;车勇良;陈如敬;吴学敏;邵良平;庄向生【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治T程技术研究中心,福建福州350013;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002;福建农林大学动物科学学院,福建福州350002【正文语种】中文【中图分类】S852.65猪流感病毒(Swine influenza virus，SIV)属正粘病毒科，A型流感病毒属，基因组约为13.6 kb，由8个独立节段组成，编码至少10个基因产物，其中节段1～3分别编码PB2、PB1和PB3聚合酶，节段4和节段6分别编码血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，节段5编码核蛋白(NP)，节段7编码病毒基质蛋白Ml和离子通道蛋白M2，节段8编码非结构蛋白NSl和NS2[1]。
猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立
猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立杨焕良;乔传玲;陈艳;辛晓光;李一经;陈化兰【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2007(029)009【摘要】对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法.采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段.其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性.对107 EID50/0.1 mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102 EID50的病毒量核酸.对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致.试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型.【总页数】5页(P714-718)【作者】杨焕良;乔传玲;陈艳;辛晓光;李一经;陈化兰【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;东北农业大学,动物医学院,黑龙江,哈尔滨,150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,农业部动物流感重点开放实验室/兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5;S854.44【相关文献】1.猪流感病毒HA和NA亚型多重RT-PCR鉴别诊断方法的建立 [J], 袁万哲;孙明谭;孙继国2.西班牙养猪密集地区同时流行A型流感病毒H1N2、H1N1和H3N2亚型的证据 [J], Jaime Maldonado;Kristien Van Reeth;Pere Riera;Marta Sitja;Narcis Saubi;Enric Espuna;Carlos Artigas;罗天海3.H1N1亚型三个谱系猪流感病毒RT-PCR鉴别诊断方法的建立 [J], 兰德松4.H3N2亚型猪流感病毒重组HA1蛋白间接ELISA诊断方法的建立 [J], 丁选亚;乔传玲;陈艳;杨焕良;辛晓光;韩庆功;陈化兰5.数字RT-PCR技术检测H3N2亚型猪流感病毒方法的建立 [J], 唐连飞;禹思宇;周宇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
H3N2亚型流感病毒分离株全基因组序列特征分析及其临床意义
H3N2亚型流感病毒分离株全基因组序列特征分析及其临床意义韦栋;张博;张东华;王铭杰;于德敏;周敏;时国朝;张欣欣【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》【年(卷),期】2015(035)011【摘要】目的分析H3N2亚型流感病毒流行株的全基因组序列及其与临床特征的相关性.方法检测2014年12月-2015年3月收集的呼吸道感染患者鼻拭子样本,对其中H3N2亚型流感病毒株PCR扩增后直接进行全基因组测序,分析其核酸序列特征及氨基酸变异情况.结果与WHO推荐2014-2015流感疫苗株参考病毒株相比,来自不同患者的14个病毒株HA1蛋白抗原决定簇均发生不同程度突变,抗原决定簇结构改变较明显的病毒株其宿主具有更高的体温和更严重的临床表现.全部14个病毒株发生HA1蛋白E190D氨基酸突变.6个病毒株NA蛋白出现1个新增糖基化位点.1个病毒株存在导致金刚烷胺耐药的M2蛋白V27A突变.全部14个病毒株PB1-F2蛋白发生I18T突变.结论 M2蛋白耐药突变的出现和PB1-F2蛋白氨基酸突变提示分离获得的H3N2流感病毒株在进化过程中曾经结合H1N1亚型流感病毒基因片段.HA1蛋白抗原决定簇突变的增加可能引发患者更强的免疫反应.【总页数】9页(P1593-1601)【作者】韦栋;张博;张东华;王铭杰;于德敏;周敏;时国朝;张欣欣【作者单位】上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院感染病与呼吸病研究所临床病毒研究室,上海200025;上海交通大学医学院附属瑞金医院北院,上海201801【正文语种】中文【中图分类】R511.7【相关文献】1.一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析 [J], 姚艳;张桂红;刘文军;陈铁桥;孙蕾;罗浑金2.猪流感病毒H3N2亚型的分离鉴定与全基因组序列测定 [J], 孙志勇;郭万柱;韩国全;陈进会;王小玉;徐志文3.一株野鸟源H3N8亚型流感病毒分离株的全基因组序列分析 [J], 兰玲;王涛;王晶;程子兵;邓国华;陈化兰4.一株H9N2亚型禽流感病毒分离株的生物学特性研究及其全基因组序列分析 [J], 刘海玲;胡自立;罗开健5.一株鸭源H8N4亚型禽流感病毒分离株的全基因组序列分析及致病性的研究 [J], 王晶;张芳;卢坤鹏;关立峥;肖丽;彭志;邓国华;陈化兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
流感病毒H_3N_2亚型HA_1基因变异分析
流感病毒H_3N_2亚型HA_1基因变异分析黄平;蔡初的;郝瑞丰;陈伟师;沈桂章;谭丽霞;倪汉忠;黄介枚【期刊名称】《中国人兽共患病杂志》【年(卷),期】1996(12)6【摘要】１９９４年流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型ＨＡ１基因核苷酸序列分析结果显示，经过２６年进化，共有１１４个核苷酸置换，引起５１个氨基酸变异，变异比例为１５．５％。
自１９６８年＂香港流感＂引起人类暴发流行以来，ＨＡ１基因核苷酸置换率４～６个／每年，氨基酸变异２～３个／每年，核苷酸和氨基酸变异速度减慢。
１９９４年三株病毒中，广东地区毒株比仙台地区和河北地区毒株多变异２～３个氨基酸；这从分子流行病学角度提示，广东地区流行毒株在目前流感病毒Ｈ３Ｎ２亚型的变异和流行中可能具有重要作用。
【总页数】5页(P3-7)【关键词】流感病毒;血凝素基因;序列分析;变异【作者】黄平;蔡初的;郝瑞丰;陈伟师;沈桂章;谭丽霞;倪汉忠;黄介枚【作者单位】广东省卫生防疫站【正文语种】中文【中图分类】R373.13【相关文献】1.河南地区一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定及HA基因变异分析 [J], 王丽荣;董永军;杭柏林;刘兴友;王三虎;胡建和2.2015—2017年上海市浦东新区H3N2亚型流感病毒流行特征与基因变异分析[J], 赵冰;叶楚楚;邹文玮;马平;刘青;孙乔;郝莉鹏;朱林英3.H_3N_2亚型人流行性感冒病毒HA_1的蛋白序列同源性比较、变异规律及结构与功能的分析 [J], 王勇;薛颖;陈淑霞;金奇;侯云德4.用PCR-RFLP方法分析流感病毒H_3N_2亚型毒株 [J], 黄平;C.A.Bender;沈桂章;周惠琼;N.J.Cox5.H_3N_2亚型犬流感病毒鼠/犬嵌合抗体scFv-Fc的制备与活性分析 [J], 赵丹;邱冬;韩德敏;刘永杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
甲型H3N2亚型流感病毒血凝素及神经氨酸酶基因变异分析的研究进展
综述甲型H3N2亚型流感病毒血凝素及神经氨酸酶基因变异分析的研究进展【摘要】流感病毒最显著地特点是极易发生变异而引起新的流行。
为了探讨甲型H3N2亚型流感病毒(A/H3N2)血凝素（HA）及神经氨酸酶(NA)基因动态变化情况，本文对近几年各地区对H3N2的HA 及NA基因变异分析进行了归纳总结。
【关键词】流感病毒，H3N2亚型；HA；NA；基因变异甲型H3N2亚型流感病毒(influenza A/H3N2 viruses,A/H3N2)自1968年引起世界大流行以来一直是人群中主要的流感亚型之一，其抗原漂移的动力学、分子特性和基因变异与流感发生和流行的关系是近几年研究的热点[1]。
A/H3N2全基因组共有8个片段，编码10种以上不同的蛋白，其中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)位于流感病毒球形结构的表面，在病毒的感染、增值及变异中起着重要的作用[2]。
为明确H3N2亚型流行株基因变异趋势，本文从其HA及NA两个基因序列方面，分别阐述了基因特性分析的研究进展。
1.HA基因进化A/H3N2的HA基因变异是最快的。
在病毒的受体识别和复制中起重要作用，包括识别和结合宿主细胞表面的受体，使毒粒囊膜和和宿主细胞膜发生融合并导致溶解，使病毒基因组进入细胞质并开始复制等。
这些活动与抗原决定簇和受体结合位点(RBS)所在的HA重链区（HA1区）关系最密切。
1.1 HA1基因变异与分析从中国H3N2HA1基因进化树可以看到典型的梯形树形，HA1进化树是一个以主干向上发展，以很短的侧枝为特征。
对2007～2010年无锡地区分离的42株H3N2流感病毒的HA基因进行分析,也表明核苷酸序列的进化树呈斜长型,进化的路径表现为一主要的进化主干向上发展[3]。
树的主干很长，基本是按毒株出现的时间先后发展。
进化树侧枝很短提示了新旧毒株的交替速度很快。
而中国1995～2005年H3N2亚型人流感病毒HA1基因序列分析也表明我国1995～2005年流行的H3N2毒株HA1的序列位点不断发生变化。
1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定
1株H3N2亚型猪流感病毒的分离鉴定齐海涛;闫军霞;粟硕;黄震;曹楠;谭力凯;孔维立;张桂红【摘要】为了解广东猪流感病毒(SIV)的流行变异情况,2010年11月从广东某规模猪场采集流感症状的猪鼻拭子60份,接种10日龄SPF鸡胚,分离到1株猪流感病毒,通过流感分型RT-PCR和HI试验鉴定为H3N2亚型SIV,命名为A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2),进行全基因序列测定及相似性分析发现,该分离株有低致病性流感分子特征,该毒株的8个基因片段连同最近广东猪群流行的流感毒株与2000年前后H3N2人流感病毒有较高的同源性.系统遗传演化显示,该病毒分离株可能是由1999年人源H3N2流感病毒A/Moscow/10/99(H3N2)进化而来.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2012(048)012【总页数】4页(P24-27)【关键词】H3N2;猪流感病毒;分离鉴定【作者】齐海涛;闫军霞;粟硕;黄震;曹楠;谭力凯;孔维立;张桂红【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642;华南农业大学兽医学院,广东广州 510642【正文语种】中文【中图分类】S855.3猪流感（SI）是由A型流感病毒引起的猪的一种急性、传染性呼吸道疾病，以发热、流鼻液、咳嗽、食欲减退等症状为特征，病猪可在短期内康复，但会降低饲料报酬，延迟上市时间。
目前猪群中的SIV主要有H1N1、H1N2和H3N2 3种亚型。
我国猪群中普遍存在H3和H1亚型感染。
更为重要的是，猪可以被禽流感病毒和人流感病毒同时感染，猪被认为是流感病毒的“混合器”，在“禽－猪－人”的传播链中具有独特的地位［1－2］，SI具有重要的公共卫生意义。
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１材料与方法 １．１毒株来源本研究的Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感毒株 均为国家流感中心保存，病毒分离时间自２０１０年１ 月至２０１５年１０月。 １．２病毒ＲＮＡ的提取及基因扩增 公司ＲＮｅａｓｙ
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些病毒进行序列测定时不工作。为了确保所有病 毒序列能够一次测通，对引物序列进行了优化，使
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即可完成纯化。因此更换试剂后，更加节省时间 及人力。
２．２
引物匹配性优化
（Ｈ，Ｎ：）亚型流感病毒进行全基因组测序，共测序 毒株３２０株，采样日期为２０１０年１月至２０１４年
５月。
在实验过程中，发现部分病毒未能通过一次 测序实验而获得全基因组序列，个别引物在对这
万方数据
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上游引物名称
Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ＰＢ２—．Ｈ３—．Ｆ—．１ Ｂ ＰＢ２—．Ｈ３——Ｆ＿４２２
ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒｓ
ＰＢ２．２ ＰＢ２．５ ＰＢ２．７ ＰＢ２．１０ ＰＢ２．１２ ＰＢ２．１５ ＰＢｌ．１ ＰＢｌ．５ ＰＢｌ－７ ＰＢｌ．１０ ＰＢｌ．１２ ＰＢｌ．１６ ＰＡ．２ ＰＡ－５ ＰＡ．９ ＰＡ．１２ ＰＡ．１５ ＨＡ．２ ＨＡ－６ ＨＡ．７ ＨＡ－９ ＨＡ．１１ ＮＰ．３ ＮＰ－５ ＮＰ．８ ＮＰ．９ ＮＡ．２ ＮＡ．４ ＮＡ．８ ＭＰ．１ ＭＰ４ ＭＰ＿６ ＮＳ．２ ＮＳ－６
ｗｅｒｅ
ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｕｓｅ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ，１９４ Ａ（Ｈ３Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ
ｗａｓ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
ａｌｌ Ａ
ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｆｕｌｌ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
序列拼接采用ＤＮＡＳｔａｒ软件中的
Ｓｅｑｍａｎ程序。序列比对使用ＭＥＧＡ ５．０软件的
Ｃｌｕｓｔａｌ
Ｗ方法。
２
结果
２．１
纯化方法优化
ＱＩＡｑｕｉｃｋ
９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
产物纯化，每纯化９６个反应约４０ ｍｉｎ，如果样品 量增多，所需的纯化时间将加倍。 改进实验方法后，使用ＵＳＢ公司的ＥｘｏＳＡＰ—ＩＴ 虾碱酶纯化，此纯化方法在加入虾碱酶后可用 ＰＣＲ仪进行热反应，无论样品量多少，只需３０
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００３—９２７９．２０１６．０５．０１３
【摘要】
目的
对流行的季节性甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒进行全基因组测序。方法本文对
甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒测序过程中的ＰＣＲ扩增引物进行优化及精简，同时对ＰＣＲ产物纯化方法
进行了改进。使用优化后的３４对ＰＣＲ引物和优化后的纯化方法，对１９４株甲型Ｈ３Ｎ２亚型病毒进
行了测序。结果利用优化后的测序方法，可保证获得甲型Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒的８个片段全基 因组序列，而且大大缩短了实验时间，节约了实验成本和人力。结论 我们应大力开展Ａ（Ｈ３Ｎ２）
亚型流感病毒的序列测定工作，及时发现病毒变异情况，以推选出与人群中的流行株更为匹配的疫
苗株。
【主题词】
流感病毒；Ｈ３Ｎ２亚型；测序；全基因组
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｆｕｎｄ
Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ；Ｈ３ Ｎ２
Ｓｕｂｔｙｐｅ；Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ
ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（２０１４ＺＸｌ０００４００２－００１－００３）
Ａ（Ｈ３ Ｎ２）ｖｉｒｕｓ，８
ｏｆ
ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｏｆ
（Ｈ３ Ｎ２）ｖｉｒｕｓｅｓ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｗｅｒｅ
ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｉｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ａｎｄ ｓａｖｅｄ Ｗｅ ｓｈｏｕｌｄ ｃａｒｒｙ
４７ｌ・
为疫苗株和流行株的匹配性，这就需要我们大力 开展序列测定和分析工作，及时发现病毒变异情
况，推选出与人群中的流行病毒更为匹配的疫苗 株，为人群提供有效的保护。
表１用于季节性Ｈ３Ｎ２亚型流感病毒测序的ＰＣＲ引物
Ｔａｂ．１ 引物编号
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ
ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｓｅａｓｏｎａｌ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ３ Ｎ２）ｖｉｒｕｓ 上游引物序列
站ｈｔｔｐ：／／ｇｓｃ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ／ｍｓｃ／ｉｎｎｕｅｎｚａ选取 人甲型Ｈ３Ｎ２亚型扩增引物，再根据后续测序反应 结果进行引物优化。所有测序引物由大连宝生物公 司合成。 使用Ｑｉａｇｅｎ公司Ｏｎｅ
Ｓｔｅｐ ＲＴ—ＰＣＲ
Ｋｉｔ进行基
定了３４对引物，扩增的目的片段之间相互重叠，能 够覆盖整个流感病毒全基因组。
时间。
３
Ｓ，７２℃１ １．３
ｍｉｎ，循环３５次；７２
ｏＣ
１０ ｍｉｎ；４
ｏＣ保存。
ＰＣＲ产物纯化及序列测定ＰＣＲ产物纯化分
９６ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
别使用Ｑｉａｇｅｎ公司ＱＩＡｑｕｉｃｋ
和ＵＳＢ公司的ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ，两种方法进行比较。测 序反应使用美国ＡＢＩ公司的ＢｉｇＤｙｅ
面揭示流感病毒的重配和变异规律。既往有研究者 曾公布Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒测序引物，本实验室 对此方法进行了优化，可在１０ ｈ左右快速获得Ａ （Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒的全基因组序列，可用于流 感病毒的日常监测和研究工作，及时进行病毒进化 分析。
万方数据
主堡塞堕塑！堕鏖疸壹堂盘查！！！！至！！旦箜！！鲞箜ｉ塑
主堡塞堕塑Ｉ堕座疸垂堂盘查！！！！笙！！旦箜！！鲞筮！塑曼！也！苎！垦！Ｐ堡！！！！坐！！Ｑ！！！！竺！！！！！！！！：！！！盟！：！
４６９
．短篇论著
Ｓａｎｇｅｒ法测定季节性Ｈ３ Ｎ２亚型流感病毒全
基因组序列
李希妍 赵翔 谭敏菊
蓝雨 成艳辉
黄维娟
王大燕
舒跃龙Βιβλιοθήκη １０２２０６北京，中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家流感中心卫生部医学病 毒和病毒病重点实验室 通信作者：王大燕，Ｅｍａｉｌ：ｄａｙａｎｗａｎｇ＠ｃｎｉｅ．ｏｒｇ．ｏｎ
Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１
Ｋｉｔ。由于ＰＣＲ引物已包含Ｍ１３接
结论
头，因此用于测序反应的引物为通用引物Ｍ１３。具 体方法参见文献［２］。
１．４序列分析
近年来，下一代测序（Ｎｅｘｔ—ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｓｅｑｕｅｎ－
ｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术相继出现并迅速发展成熟。ＮＧＳ 以高通量、低成本为主要特点¨。，不过，由于ＮＧＳ 技术相关的仪器费用较高，不利于广泛推广。而 １９７７年Ｓａｎｇｅｒ发明的双脱氧末端终止法，即第一 代测序技术，拥有较长读长（平均读长７００ ｂｐ）和 极高准确率（９９．９％）‘４１，对于少量测序仍是最佳 最初使用Ｑｉａｇｅｎ公司的 Ｋｉｔ滤膜法进行ＰＣＲ 选择。 目前有些实验室已有第一代测序平台，但是缺 乏有效的测序引物，不能得以充分利用，所以我们希 望共享我们优化后的测序方法。使用经过我们优化 的测序引物对Ａ（Ｈ３Ｎ２）流感病毒进行测序，其匹配 性更高，而且大大减少了ＰＣＲ扩增的数量，可以节 约成本。 流感病毒抗原性易变，传播迅速，每年可引起 季节性流行，并且在人群聚集的场所可发生暴发 使用８９对ＰＣＲ引物对Ａ 疫情。对孕妇、婴幼儿、老年人和慢性病患者等高 危人群的危害尤为严重，接种流感疫苗是目前预 防流感、降低流感疾病负担最有效的手段¨１。由 于流感病毒易发生抗原性漂移和抗原性转变，而 目前全球已上市的流感疫苗都不能克服流感病毒 易于变异的特点，影响疫苗免疫效果的主要因素
用Ｐｒｉｍｅｒ
Ｐｒｅｍｉｅｒ
５．０软件，根据已知病毒序列，设
计并更换了４对引物，分别为ＰＢｌ．５、ＰＢｌ—７、ＰＢｌ－８
和ＰＡ－１
１。
利用Ｑｉａｇｅｎ
２．３
引物数量优化
用８９对引物对Ａ（Ｈ，Ｎ：）亚
Ｋｉｔ试剂盒进行ＲＮＡ提取。从网
型流感病毒进行ＰＣＲ反应，再使用通用引物Ｍ１３分 别进行正反向测序反应，最终获得１７８条序列，拼接 后发现，每一核苷酸位点有４至９个测序反应。为 了节约成本，能够在最短时间内完成全基因组测序 工作，对测序所使用的ＰＣＲ引物进行精简。最终确
甲型Ｈ３Ｎ２［Ａ（Ｈ３Ｎ２）］亚型流感病毒于１９６８ 年引起了全球范围的流感大流行，此后一直在人群 中呈季节性流行。对流感病毒表面蛋白ＨＡ基因的 分析表明，与人群中流行的其他季节性流感病毒相 比，Ａ（Ｈ３Ｎ２）亚型流感病毒的进化和变异最为迅 速¨１。流感病毒是分节段的ＲＮＡ病毒，对流感病毒 全基因组８个基因片段的综合分析，可以进一步全
２．４
因扩增，反应体系为１０¨ｌ。具体操作方法参见试剂 盒说明书。ＰＣＲ反应条件为６０
ｍｉｎ；５０ ｏＣ ２０ ｍｉｎ；９５
ｏＣ
１
ｍｉｎ；４２℃２０
引物验证
使用筛选出的３４对引物对采样
ｏＣ
１５ ｍｉｎ；９４℃３０ Ｓ，５５℃３０
日期在２０１４年３月至２０１５年１０月之间的１９４株 Ａ（Ｈ，Ｎ，）亚型流感病毒进行测序，结果表明仅使 用此３４对引物，可以完成流感病毒所有８个片段 的全基因组测序，显著减少了实验成本和实验
ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ
Ｄｉｓｅａｓｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ