BacillussubtilisNX-2聚谷氨酸合成酶基因pgsBCA的克隆及生物信息学分析
微生物聚谷氨酸(γ-PGA)合成酶及合成机理的研究进展
微生物聚谷氨酸(γ-PGA)合成酶及合成机理的研究进展郑重;吴剑光;邱乐泉;钟卫鸿【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2010(000)006【摘要】γ-PGA是一种可降解的、水溶性的,对人体无毒的生物高分子.目前发现多种微生物能合成γ-PGA,包括芽孢杆菌、古生菌和一种真核生物.γ-PGA合成基因可分为capB、capC、capA、capE和pgsB、pgsC、pgsA和pgsE,其表达产物组成的γ-PGA合成酶复合体与细胞膜结合,并消耗ATP及底物谷氨酸进而合成γ-PGA,其中CapB-CapC(或者PgsB-PgsC)主要负责γ-PGA的聚合作用,而CapA-CapE(或者PgsA-PgsE)则作用于γ-PGA的转运.ComP-ComA、DegS-DegU、DegQ、SwrA和pgsB上游的非编码区则对pgsB、C、A和E的表达起重要影响.【总页数】6页(P52-56,64)【作者】郑重;吴剑光;邱乐泉;钟卫鸿【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州,310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州,310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州,310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,杭州,310032【正文语种】中文【相关文献】1.微生物絮凝剂γ-聚谷氨酸的生产及应用研究进展 [J], 邵颖;赵彩凤;邵赛;张乐平2.Bacillus methylotrophicus γ-聚谷氨酸合成酶基因的克隆表达 [J], 彭英云;张涛;江波;沐万孟;缪铭3.微生物源低聚果糖合成酶的研究进展 [J], 王立梅;齐斌4.微生物合成γ-聚谷氨酸的相关基因、合成机理及发酵的研究进展 [J], 严涛;郗洪生5.低氮下拟南芥叶酰聚谷氨酸合成酶突变体atdfb根发育研究 [J], 孟红岩;汪文华;张春义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
微生物合成的聚谷氨酸及其应用
收稿日期： ２００７－１２－２１ 作者简介： 张艳丽（ １９８２－） ， 女， 硕士研究生， 研究方向： 天然活性物的提取及应用研究 通讯作者： 高华， 教授， 硕士生导师， 电话：０５３２－８３８１２４３５， Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｏｈｕａ６３＠１２６．ｃｏｍ
２００８ 年第 ４ 期
张艳丽等： 微生物合成的聚谷氨酸及其应用
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： γ－ ＰＧＡ（ Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ） Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｔｒａｉｎｓ Ｇｅｎｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
γ－聚 谷 氨 酸 （ γ－ＰＧＡ） 是 一 种 由 Ｄ－和 Ｌ－谷 氨 酸 通 过 γ－谷 氨 酰 键 结 合 而 成 的 一 种 特 殊 的 阴 离 子 聚 合 物 ， 通 常 由 ５ ０００ 个 左 右 的 谷 氨 酸 单 体 组 成 ， 相 对 分 子 量 一 般 在 １０ 万 ～２００ 万 之 间 。 最 早 于 １９３７ 年 Ｉｖａｎｏｖｉｃ 等 发 现 炭 疽 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ） 的 荚 膜 物 质 的 主 要 成 分 是 Ｄ－谷 氨 酸 的 聚 合 物 。 而 １９４２ 年 Ｂｏｖａｍｉｃｋ 等 首 次 发 现 枯 草 芽 孢 杆 菌 能 够 产 生 γ－聚 谷 氨 酸 ， 以 后 进 一 步 发 现 短 小 芽 孢 杆 菌 及 地 衣 芽 孢 杆 菌 等 也 能 产 生 γ－ＰＧＡ。由 于 微 生 物 合 成 的 γ－ＰＧＡ 是 一 种 水 溶 性 的 、生 物 可 降 解 的 、对 人 体 和环境无害的生物高分子， 因此具有广阔的应用前 景 ： 可 作 为 增 稠 剂 、保 湿 剂 、苦 味 掩 盖 剂 、防 冻 剂 、缓 释 剂 、生 物 粘 合 剂 、药 物 载 体 、高 分 子 纤 维 、高 吸 水 树脂、生物絮凝剂和重金属吸附剂而应用于食品、 化 妆 品 、医 药 、农 业 及 工 业 等 众 多 领 域 ［１］。
_聚谷氨酸的研究进展
γ-聚谷氨酸的研究进展王浩1 杨丽萍2 乔君2 赵祥颖2 刘建军1,2（1.山东轻工业学院食品与生物工程学院济南 250353 ）（2.山东食品发酵工程重点实验室济南 250013）摘 要：γ-聚谷氨酸(Po l y-γ-gl u t a m i c a c i d；γ-P GA)是以L-、D-型谷氨酸为单体通过γ-酰胺键聚合而成的一种均聚氨基酸聚合物。
γ-聚谷氨酸具有水溶性、可生物降解性和可食用性且对人和环境无毒的诸多优点，这使得γ-聚谷氨酸及其衍生物在食品、化妆品、医药和农业等领域具有广阔的应用前景。
关键词：γ-聚谷氨酸 生产 应用γ-聚谷氨酸[Poly(γ-glutamic acid),γ-PGA]是由D-/L-谷氨酸通过γ-酰胺键聚合而成的一种高分子阴离子多肽型聚合物。
生物合成的γ-聚谷氨酸的立体构型分为γ-聚D-谷氨酸(γ-D-PGA)、γ-聚L-谷氨酸(γ-L-PGA)和γ-聚D/L-谷氨酸(γ-D/L-PGA)3种。
γ-聚谷氨酸主链上含有大量游离羧基，可发生交联、螯合、衍生化等反应，具有强水溶性、生物相容性、生物降解性等，随着人们环保意识日益增强，γ-聚谷氨酸作为可生物降解高分子材料已备受关注。
本文介绍了γ-聚谷氨酸的结构性质、生产方法、研究历史、现状及应用前景。
1 γ-聚谷氨酸的结构与性质1.1 γ-聚谷氨酸的结构γ-聚谷氨酸是一种通过微生物合成的均聚氨基酸化合物，由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）单体通过酰胺键聚合而成的一种多肽分子[1]，通常是由500~5000个左右的谷氨酸单体组成，相对分子质量在100~1000kD之间，其结构式如图1所示。
图1 γ-聚谷氨酸的结构式γ-PGA是一种不寻常的阴离子异形肽，目前的初步研究认为它的基本骨架是由γ-酰胺键连接而成的直链纤维分子，没有典型的肽链结Study of Poly-γ-glutamic acidWang Hao1, ZhaoXiang-ying2, LIU Jian-jun1,2*（1.College of Food and Bioengineering,Shandong Institute of Light Industry,Jinan,250353）（2.Food& Fermentation Engineering Key Lab of Shandong Province,Jinan,250013）Abstract：Poly-γ-glutamic acid is a compound of equal poly amino acid that consist of L- and D-glutamic acids through γ-glutamyl bonds.γ-PGA is water-soluble, biodegradable, edible and non-toxic toward human and the environment. Therefore, potential applications of γ-PGA and its derivatives have been of interest in abroad range of industrial fi elds such as food, cosmetics, medicine and agriculture.Key words：γ-PGA; production; application构，也不是一种环状多肽，链之间存在大量氢键。
枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达
枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）是一种在垃圾堆、陆地和淡水中常见的细菌，它可以合成淀粉酶，参与食品加工和制药等领域。
为了深入研究芽孢杆菌产淀粉酶的机制，本文旨在克隆和表达枯草芽孢杆菌的淀粉酶基因，为今后的更深入研究奠定基础。
研究中，我们首先从枯草芽孢杆菌的形态学特性中确定菌株，然后利用定点突变技术，以外源基因引入枯草芽孢杆菌，以达到调控基因表达的目的。
实验中，通过对枯草芽孢杆菌分离介质DNA的提取、限制性内切酶扩增以及后续的PCR扩增，我们能够从大量杂合DNA中克隆出淀粉酶基因的片段，然后进行终止密码子转录、酶切以及连接方面的实验，最终可以将淀粉酶基因克隆入宿主细菌质粒中，从而表达淀粉酶蛋白。
经过蛋白质免疫印迹分析，可以看到从枯草芽孢杆菌中克隆和表达的具有淀粉酶功能的蛋白质，在不同pH条件下具有较强的淀粉水解能力，与未经克隆表达的芽孢杆菌菌株相比，淀粉酶产量有了显著提高。
基于以上结果，我们总结出了枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达的技术方案，为今后的深入研究提供基础，也为特定乳酸菌淀粉酶防护剂的研发提供参考价值。
本文通过介绍枯草芽孢杆菌产淀粉酶基因的克隆与表达，探索了枯草芽孢杆菌淀粉酶的分子机制，证明了定点突变技术对淀粉水解能力的增强作用，为淀粉酶的进一步研究提供了可靠的技术手段。
未来，
我们将借助于新的基因技术等技术平台，进一步深入研究芽孢杆菌淀粉酶的功能、结构和稳定性，以期能更好地利用该酶的乳化作用，为食品加工和药物制造等领域提供支持。
γ-聚谷氨酸的生物合成及提取工艺
形成剪切力作用，对培养群体细胞产生不利影响。之外，搅 因此，根据实验研究发现，搅拌转速越高，此时菌体的代谢
拌转速较大，还会形成大量泡沫，使发酵体积增加，对于发 酵来说是不利的，因此，研究非流动型流体发酵参数，利于 优化发酵过程，提高 γ-PGA 产率。本研究在 5L 发酵罐中分析 了不同转速对于分批发酵 γ-PGA 的影响，具体如下。 1.1 实验材料
Abstract ：γ-Polyglutamic acid is an important biopolymer material，with good water solubility and biodegradability，and is widely used in many fields such as medicine and food.Focus on the analysis of the preparation process of γ-polyglutamic acid，expound the influence of stirring speed on the batch fermentation of Bacillus snbtilis NX2 r-polyglutamic acid，construct the kinetic model of γ-polyglutamic acid batch fermentation，and explore the effect of γ-polyglutamic acid on the batch fermentation of Bacillus snbtilis NX2.The extraction process of polyglutamic acid.
本实验中使用菌株分批发酵，结合上述实验方法，通过 发酵获得 γ-PGA 发酵液，将发酵液稀释 25 倍之后，使其光密 度值为 0.323，浓度对应 24g/L，发酵液呈淡黄色。将 pH 调至 3.0，取 1L 发酵液，分别采用不同孔径微滤膜处理，比较发酵 原液以及透过液菌体含量、产物浓度，计算菌体去除率以及 产物损失率。 5.2 实验结果
谷氨酸棒杆菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表达及固定化
谷氨酸棒杆菌中谷氨酰胺合成酶的克隆表达及固定化曹慧萍;郑璞;唐云平;徐志南【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2016(035)008【摘要】对谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)来源的谷氨酰胺合成酶进行腺苷酰化位点定点突变,并在大肠杆菌中进行异源表达,得到的重组酶活为6.215 U/mg分离纯化重组突变酶后,对其固定化条件及固定化酶的性质进行研究结果得到固定化条件为:以LX-1000EP树脂作为固定载体,载体量0.176 g/U、pH值8.0、温度30℃、吸附时间16h 固定化酶活力达到3.658 U/g,酶活回收率达到67.17％ . 重组酶固定化后,反应最适温度没有变化,最适pH略向碱性偏移,储藏稳定性提高,转化谷氨酸生产谷氨酰胺的水平与游离酶相当,对50 mmol/L谷氨酸的转化率为92.83％,为酶法生产谷氨酰胺后续研究提供了参考.【总页数】7页(P883-889)【作者】曹慧萍;郑璞;唐云平;徐志南【作者单位】江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;浙江大学化学工程与生物工程学院,浙江杭州310013;浙江大学化学工程与生物工程学院,浙江杭州310013【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.谷氨酸棒杆菌3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7磷酸合成酶基因的克隆与过量表达[J], 王玉华;于含松;刘加欢;刘回民;胡耀辉2.谷氨酰胺合成酶基因的过量表达有效提高谷氨酸棒杆菌中L-谷氨酰胺产量 [J], 郑强;阮红;徐志南;杨卫军3.利用谷氨酸棒状杆菌高效表达枯草芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶发酵生产L-谷氨酰胺 [J], 白婧;吴桐思雨;王期;殷志敏4.枯草芽胞杆菌谷氨酰胺转氨酶在谷氨酸棒杆菌中的分泌表达及诱导条件的优化[J], 黄琳;刘逸寒;李明杰;李瑞;郭伟;桂爽;路福平5.谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达 [J], 张文德;乔宇;丁宏标因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
谷胱甘肽合成酶系的克隆、测序及表达
!"卷!期#$$!年!月生物工程学报!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12%&’(!")&(!*+,-+./!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!#$$!收稿日期：#$$$0$"0!1，修回日期：#$$$0!$0#$。
"通讯作者。
23’：450#!056#7#14!；8+9：450#!056#7$$54；:0;+<’：=>?@3<!3A -B C (3=-(A ,谷胱甘肽合成酶系的克隆、测序及表达沈立新魏东芝"赵哲峰张嗣良王二力（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，生物化学研究所，上海#$$#D "）关键词"0谷氨酰半胱氨酸合成酶，谷胱甘肽合成酶中图分类号E "7D 文献标识码F 文章编号!$$$0D $5!（#$$!）$!0$$140$D 谷胱甘肽（G ’-C +C ?<&,3，G H I ）是由"0谷氨酰半胱氨酸合成酶（G H I J ）及谷胱甘肽合成酶（G H I J J ）连续催化合成的一种巯基化合物，有维持细胞正常的还原状态、保护细胞免受重金属的侵害等重要的生理功能，在临床、食品、保健品等方面有广泛的用途，如：重金属解毒、癌症的辐射和化疗的保护、I J %的抑制、抗氧化等。
近年来，采用K )F 重组技术构建高G H I 合成活性的重组菌成为G H I 生物合成研究中的新方向。
L -.+C +［!］等成功构建了具有较高G H I 合成活性的重组340(,#。
国内曾对酵母发酵过程优化及提取进行了研究［#，D ］，李寅［6］等对一株重组大肠杆菌M H I 0N :J （韩国仁荷大学赠）的高密度培养合成G H I 进行了研究，培养后期，由于酶表达量的减少及酶活的降低导致胞内G H I 的含量下降。
微生物聚谷氨酸(γ-PGA)合成酶及合成机理的研究进展
２０１０年第６期郑重等：微生物聚谷氨酸（Ｙ—ＰＧＡ）合成酶及合成机理的研究进展５５酰一Ａ；然后谷氨酰连接到１一ＰＧＡ片段上，并脱去Ａ，完成１．ＰＧＡ片段的延伸。
但是，Ａｓｈｉｕｃｈｉ等¨刮于２００１年在一株Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌ函中发现，该菌在合成．ｙ—ＰＧＡ时，ＡＴＰ水解形成的是ＡＤＰ，而非ＡＭＰ，而由于ｃａｐＢ的表达蛋白ＣａｐＢ属于氨基连接酶¨“，他们提出了另一条合成机制。
首先ＡＴＰ被ＡＴＰ水解酶水解为ＡＤＰ和Ｐｉ。
然后磷酸基团结合到小分子７一ＰＧＡ的ｃ．末端，之后Ｄ－或者Ｌ．谷氨酸的氨基端与Ｃ端磷酸化了的小分子１一ＰＧＡ发生亲核攻击，生成Ｐｉ并延伸＾ｙ．ＰＧＡ链。
但是该机制仍待证明，比如引物分子是否是小分子＇一ＰＧＡ，其反应位置具体在何处等。
３．３＾ｙ．ＰＧＡ合成酶各组分的功能目前，仍然不知道Ｙ—ＰＧＡ合成酶如何催化合成上述一系列反应。
虽然已经得知＾ｙ—ＰＧＡ合成的必需基因（即ｐｇｓＢＣＡＥ和ｃａｐＢＣＡＥ），但是其合成的各个蛋白（ＰｇｓＢＣＡＥ和ＣａｐＢＣＡＥ）的具体功能，仍待考察。
在Ｙ－ＰＧＡ生物合成过程中，可以人为将其分为两个部分，＾ｙ．ＰＧＡ的聚合与１．ＰＧＡ的转运。
１９９７年，Ｅｖｅｌａｎｄ¨刊对ＣａｐＢ／ＰｇｓＢ蛋白进行序列分析，发现其拥有一段序列与ＡＴＰ酶相似度很高，可能含有ＡＴＰ酶的活性并含有ＡＴＰ结合位点（图４）。
Ｕｒｕｓｈ．ｉｂａｔａ嵋叫于２００２年称，ＰｇｓＢ能够在试管中单独催化聚合１一ＰＧＡ，但是ＰｇｓＢ的两种形式（３３ｋＤ和４４ｋＤ）必须同时存在，并且该酶很稳定，对变性剂有一定抵御能力。
但是Ａｓｈｉｕｅｈｉ等旧１于２００３年用Ｕｒｕ．ｓｈｉｂａｔａ¨ｕ的方法进行验证性试验，却发现没有１．ＰＧＡ。
以上试验，说明ＰｇｓＢ是否具有ＡＴＰ酶活性，仍待研究。
但是他们都报道了¨毛驯ＰｇｓＢ和魄ｓＣ的混合物具有ＡＴＰ酶活性，说明ＰｇｓＢ和ＰｇｓＣ很可能形成～种复合物，进而催化１．ＰＧＡ的聚合。
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性 最高 ， 其含有 ４个跨膜 区域 ， 是疏水性膜 结合蛋 白 ；ｇＡ为亲水性稳定蛋 白， Ｎ端存在 １个跨膜 区域 。 Ｐｓ 在
Ｂ ｃｌ ｓｓｂｉｓＮ ａ ｉｕ ｕ ｔｉ Ｘ一 谷 氨 酸 合 成 酶 基 因 ｌ ｌ ２聚 ｐ ｓ Ｃ 的 克 隆 及 生 物 信 息 学 分 析 ｇＢ Ａ
张 丹 ， 徐 虹 ， 李 莎 ， 宗奇 ， 许 魏 艳
（ ９
摘
要 ： 隆 Ｂ ｃｌｓ ｕｔｉＮ ２ 中的 聚 谷 氨 酸合 成酶 基 因 ｐ ｓＣ 克 ａｉｕ ｓｂｉｓ Ｘ一 ｌ ｌ ｇＢ Ａ并 进 行 测序 。应 用 生 物信 息 学 分 析 方 法 和 工
具 对 Ｐ ｓ 、ｇＣ、ｇＡ蛋 白质的理化性 质 、 膜 区域 、 号肽 、 ｇＢ Ｐ ｓ Ｐ ｓ 跨 信 细胞 定位 等进 行分 析和 预测 ， 并探 讨 它们 的作 用方
关键词 ：ａｉｕ ｕｔｉ 生物信息 学；ｇＢ Ａ基 因； 列分析 Ｂ ｃ ｌ ｓｂｉｓ ｌ ｓ ｌ； ｐｓＣ 序 中图分 类号 ： ７ Ｑ５ 文 献标 志码 ： Ａ 文章 编号 ：６ ２— ６ ８ ２ １ ）５—０ ５ ０ １７ ３ ７ （０ １ ０ ０ ３— ６
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第 ９卷 第 ５期 ２ １ 年 ９月 ０１
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加
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