微生物合成的聚谷氨酸及其应用

·综 述 与 专 论·
生物技术通报
ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ
２００８ 年第 ４ 期
微生物合成的聚谷氨酸及其应用
张艳丽 高华 刘小红
（ 青 岛 大 学 医 学 院 药 学 系 ， 青 岛 ２６６０７１）
摘 要： γ－ 聚谷氨酸是一种全天然的、可食用的、具有多功能性的阴离子聚合物， 可由微生物发酵合成。随着材料 科学、聚合物化学和生物医学的不断发展和紧密融合， 生物可降解高分子材料的研究得到长足发展， γ－ 聚谷氨酸的开发 研究则日益深入。但国内研究仍处于实验室阶段， 还未实现工业化生产。介绍了 γ－ 聚谷氨酸的结构、理化性质及其影响 因素， 综述了其合成菌株、培养方法、相关基因及在医药、食品、化妆品、农业、工业等方面的应用。
１ γ－ＰＧＡ 的 理 化 特 性 １．１ γ－ ＰＧＡ 的 化 学 结 构
ＰＧＡ 以 形 成 肽 键 的 羧 基 类 型 为 依 据 可 分 为 #－ ＰＧＡ（ 化学合成） 和 γ－ＰＧＡ（ 微生物合成） ， 结构如图 １。
图 １ ＰＧＡ 的结构
由 于 γ－ＰＧＡ 的 谷 氨 酰 基 通 过 γ－键 连 接 ， 不 同 于前者的 $－酰胺键， 它能耐受蛋 白酶 的 降 解 作 用 （ 也 与 蛋 白 质 不 同 ） 。到 目 前 为 止 ， 已 发 现 γ－ＰＧＡ 有
收稿日期： ２００７－１２－２１ 作者简介： 张艳丽（ １９８２－） ， 女， 硕士研究生， 研究方向： 天然活性物的提取及应用研究 通讯作者： 高华， 教授， 硕士生导师， 电话：０５３２－８３８１２４３５， Ｅ－ｍａｉｌ：ｇａｏｈｕａ６３＠１２６．ｃｏｍ
２００８ 年第 ４ 期
张艳丽等： 微生物合成的聚谷氨酸及其应用
目 前 研 究 者 还 利 用 一 些 菌 株 来 合 成 γ－ＰＧＡ 的 衍 生 物 、混 合 物 ， 扩 展 了 其 应 用 前 景 。如 Ｓｈｉｈ［１３］等 人 发 现 枯 草 芽 孢 杆 菌 Ｃ１（ 一 种 非 谷 氨 酸 依 赖 性 细 菌 ） 能 合 成 一 种 甘 油 和 γ－ＰＧＡ 相 结 合 的 衍 生 物 ， γ－ＰＧＡ 中 Ｄ－谷 氨 酸 占 ９７％以 上 ， 且 所 占 比 例 与 Ｍｎ２＋浓 度 无 关 （ 这 与 地 衣 芽 孢 杆 菌 不 同 ） 。 另 外 Ｗａｎｇ Ｑ．Ｊ．［１４］ 等人还以大豆和甘薯为原料通过枯草芽孢杆菌 Ｂ６－１ 合 成 脂 肽 和 γ－ＰＧＡ 的 共 聚 物 ， 可 作 为 生 物 控 制剂和肥料增效剂， 抑制植物的枯萎和病菌的感染。
用 提 取 法 ， 用 乙 醇 将 纳 豆 中 的 ＰＧＡ 分 离 提 取 出 来 。 由 于 纳 豆 中 所 含 的 γ－ＰＧＡ 浓 度 甚 微 ， 且 有 波 动 ， 因 此提取工艺十分复杂， 生产成本甚高， 同样难以大 规模生产。 ２．１．３ 微生物发酵合成法 是最常用的方法， 但迄 今为止的发酵生产仍处于实验室阶段。
２ γ－ＰＧＡ 的 合 成 ２．１ γ－ ＰＧＡ 的 产 生 菌
自 从 １９３７ 年 γ－ＰＧＡ 的 发 现 以 来 ， 众 多 学 者 相 继 开 展 了 γ－ＰＧＡ 高 产 菌 株 的 选 育 、代 谢 途 径 、发 酵 工 艺 、 分 离 纯 化 工 艺 以 及 应 用 的 研 究 ， 但 至 今 γ－ ＰＧＡ 的 代 谢 途 径 仍 然 是 推 测 途 径 ， 生 产 菌 株 的 合 成 能力较低， 导致生产成本高， 影响其在各领域的广 泛 应 用 。 目 前 生 产 方 法 主 要 包 括 化 学 合 成 法 、提 取 法 、利 用 传 统 菌 种 进 行 发 酵 法［４］。 ２．１．１ 化学合成法 是肽类合成的重要方法（ 最早 由 匈 牙 利 学 者 采 用 ） ， 但 合 成 路 线 长 、副 产 物 多 、收 率 低 、难 度 大 ， 尤 其 是 含 ２０ 个 氨 基 酸 以 上 的 纯 多 肽 合成， 因此无工业应用价值。 ２．１．２ 提 取 法 合成早期， 日本生产 γ－ＰＧＡ 大多采
上 述 γ－ＰＧＡ 产 生 菌 通 常 可 按 照 其 营 养 要 求 分 为两大类： 谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖型。需谷 氨 酸 的 γ－ＰＧＡ 产 生 菌 ， 其 培 养 基 一 般 要 求 谷 氨 酸 维持一种较高的水平， 同时混合加入葡萄糖和甘油 会 增 强 谷 氨 酸 和 柠 檬 酸 （ 是 大 部 分 ＰＧＡ 生 产 菌 的 最适碳 源） 的代谢， 相应提高 了 γ－ＰＧＡ 的 产 率［１５］。目 前研究较多的为前者， 以 Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ９９４５ａ 和 Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＩＦＯ３３３５ 为 代 表 ， 其 产 率 相 对 比 非 谷 氨 酸依赖型的较高， 但从生产成本考虑， 不需谷氨酸 作为发酵底物的菌株更有优势， 具有工业化应用前 景。
发酵菌株主要是芽胞杆菌属的一些细菌（ 均为 Ｇ＋菌 ） ， 如 最 早 发 现 的 炭 疽 芽 孢 杆 菌 随 环 境 中 ＣＯ２ 浓 度 的 增 加 而 合 成 γ－ＰＧＡ， 且 连 于 细 胞 壁 上 ， 在 细 胞周围形成一层荚膜， 但此菌由于自身的毒性而不 适 于 γ－ＰＧＡ 的 工 业 生 产 。 而 枯 草 芽 胞 杆 菌 和 地 衣 芽 孢 杆 菌 合 成 的 γ－ＰＧＡ 能 分 泌 至 培 养 基 中 ， 因 此 成 为 目 前 研 究 最 广 泛 的 菌 种 （ 表 １） 。分 泌 的 γ－ＰＧＡ 可作为一种胞外营养储备， 促进生物被膜的形成， 而且能保护细胞免受吞噬细胞的侵袭和高盐损伤。 除了一些能产生芽胞的细菌， 还发现两种嗜盐真菌 也 能 合 成 γ－ＰＧＡ。此 外 真 核 细 胞 （ 如 水 蛭 的 刺 细 胞 ） 也 能 合 成 γ－ＰＧＡ， 但 其 仅 发 生 于 荚 膜 壁 中 （ 仅 在 荚 膜壁中检测到） ， 且晚于荚膜形成， 伴随发生的是渗 透 压 增 大 导 致 荚 膜 隆 起［１２］。
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： γ－ ＰＧＡ（ Ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ） Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｔｒａｉｎｓ Ｇｅｎｅ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
γ－聚 谷 氨 酸 （ γ－ＰＧＡ） 是 一 种 由 Ｄ－和 Ｌ－谷 氨 酸 通 过 γ－谷 氨 酰 键 结 合 而 成 的 一 种 特 殊 的 阴 离 子 聚 合 物 ， 通 常 由 ５ ０００ 个 左 右 的 谷 氨 酸 单 体 组 成 ， 相 对 分 子 量 一 般 在 １０ 万 ～２００ 万 之 间 。 最 早 于 １９３７ 年 Ｉｖａｎｏｖｉｃ 等 发 现 炭 疽 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ） 的 荚 膜 物 质 的 主 要 成 分 是 Ｄ－谷 氨 酸 的 聚 合 物 。 而 １９４２ 年 Ｂｏｖａｍｉｃｋ 等 首 次 发 现 枯 草 芽 孢 杆 菌 能 够 产 生 γ－聚 谷 氨 酸 ， 以 后 进 一 步 发 现 短 小 芽 孢 杆 菌 及 地 衣 芽 孢 杆 菌 等 也 能 产 生 γ－ＰＧＡ。由 于 微 生 物 合 成 的 γ－ＰＧＡ 是 一 种 水 溶 性 的 、生 物 可 降 解 的 、对 人 体 和环境无害的生物高分子， 因此具有广阔的应用前 景 ： 可 作 为 增 稠 剂 、保 湿 剂 、苦 味 掩 盖 剂 、防 冻 剂 、缓 释 剂 、生 物 粘 合 剂 、药 物 载 体 、高 分 子 纤 维 、高 吸 水 树脂、生物絮凝剂和重金属吸附剂而应用于食品、 化 妆 品 、医 药 、农 业 及 工 业 等 众 多 领 域 ［１］。
Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ： γ－ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒ， ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｎａｔｕｒａｌ， ｕｎｕｓｕａｌ ａｎｉｏｎｉｃ ａｎｄ ｅｄｉｂｌｅ． Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｂｏｕｔ ｐｏｌｙｍｅｒｓ， ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｆｌｕｅｎｓ， ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｒｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｇｒｅａｔｌｙ． Ｔｈｕｓ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｂｏｕｔ γ－ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｈａｓ ａｔｔｒａｃｔｅｄ ｍｕｃｈ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｃｈｉｎａ， ｈｏｗｅｖｅｒ， ｉｓ ｓｔｉｌｌ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ． Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃｏ－ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ γ－ ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ． Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ， ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ， ｃｕｌｔｕｒａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ， ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ｆｏｏｄ， ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ， ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｗｅｒｅ ｒｅｖｉｅｗｅｄ．
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３ 种 不 同 的 立 体 化 学 结 构 ： Ｄ－ＰＧＡ （ 由 Ｄ－谷 氨 酸 组 成的均 聚物） 、Ｌ－ＰＧＡ （ 由 Ｌ－谷氨酸组 成 的 均 聚 物 ） 、 ＤＬ－ＰＧＡ （ Ｄ－和 Ｌ－谷氨酸随 机连接构成的共聚 物 ） ［２］。 其 主 要 取 决 于 所 用 菌 种 及 培 养 基 组 成 。炭 疽 芽 胞 杆 菌 合 成 的 γ－ＰＧＡ 仅 由 Ｄ－谷 氨 酸 组 成 ； 而 地 衣 芽 孢 杆 菌 产 生 的 γ－ＰＧＡ 中 Ｄ－谷 氨 酸 所 占 比 例 随 着 培 养 基 中 金 属 离 子 （ 尤 其 是 Ｍｎ２＋） 的 变 化 而 变 化 （ １０％￣ １００％ ） ； 枯 草 芽 胞 杆 菌 的 一 些 菌 种 包 括 从 纳 豆 （ 日 本一种传统的发酵食品） 中筛选的纳豆芽孢杆菌产 生 的 胞 外 粘 液 的 主 要 成 分 则 是 ＤＬ－ＰＧＡ（ Ｄ－谷 氨 酸 占 ６０ ±１５％ ； Ｌ－谷 氨 酸 占 ４０ ±１５％ ） ； 枯 草 菌 亚 种 Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋｊａｎｇ 的 培 养 基 中 加 入 （ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 时 Ｄ－谷 氨 酸 、Ｌ－谷 氨 酸 各 占 ４２．５±７．５％ 、５７．５±７．５％ ， 而 当 不 加 入 （ ＮＨ４） ２ＳＯ４ 时 Ｄ－谷 氨 酸 占 ７２．５ ±７．５％［３］； 近 来 所 发 现 的 依 赖 ＮａＣｌ 合 成 ＰＧＡ 的 巨 大 芽 胞 杆 菌 在 高 盐 环 境 下 合 成 的 ＰＧＡ 富 含 Ｌ－谷 氨 酸 ， 且 随 培 养基中盐浓度的降低， Ｌ－谷氨酸的比例也逐 渐降低。 １．２ γ－ ＰＧＡ 的 物 理 性 质