重组DNA技术的操作过程
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状
重组dna技术的名词解释_操作步骤_产业现状重组dna技术的名词解释基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
重组dna技术的操作步骤工具(1)酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、(2)载体：质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体1.提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。
如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。
科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因;另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA(即外源DNA)的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增，如使用PCR技术)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
人工合成基因的方法主要有两条。
一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。
另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤重组DNA技术的主要步骤引言：重组DNA技术是一种重要的生物技术，它可以改变生物体的遗传信息，为人类的科学研究和生产带来了巨大的便利。
本文将介绍重组DNA技术的主要步骤，包括DNA提取、限制酶切割、连接反应、载体转化和筛选等。
通过合理的组织和流畅的叙述，读者将能够清晰地了解重组DNA技术的整个过程。
一、DNA提取DNA提取是重组DNA技术的第一步，它的目的是从生物体中获取所需的DNA片段。
通常采用的方法有物理法和化学法。
物理法是通过机械破碎和离心等手段将细胞破裂，然后用溶液提取DNA。
化学法则是利用细胞膜的溶解特性和DNA的溶解性，在适当的缓冲液中加入酶和溶剂，将DNA从细胞中释放出来。
无论是哪种方法，DNA 提取的关键在于保持DNA的完整性和纯度。
二、限制酶切割限制酶切割是重组DNA技术的核心步骤之一。
限制酶是一类能够识别特定的DNA序列并切割它们的酶，它们可以将DNA分子切割成特定的片段。
在限制酶切割过程中，需要选择适当的限制酶，并在合适的温度和pH值下进行反应。
通过限制酶切割，可以获得具有特定序列的DNA片段，为后续的连接反应提供基础。
三、连接反应连接反应是将目标DNA片段与载体DNA连接在一起的过程。
在连接反应中，需要使用DNA连接酶将目标DNA片段与载体DNA的末端连接起来。
连接酶会识别DNA的末端序列，并在适当的条件下进行连接。
连接反应的成功与否直接影响到重组DNA技术的后续步骤和效果。
四、载体转化载体转化是将重组DNA导入到宿主细胞中的过程。
通常采用细菌作为宿主细胞，因为细菌具有较高的转化效率和较好的生长条件。
在载体转化过程中，需要将重组DNA与宿主细胞共孵育，并通过适当的操作使重组DNA进入细菌细胞内。
转化成功后，细菌细胞将能够表达重组DNA所携带的目标基因，并产生相应的蛋白质。
五、筛选筛选是重组DNA技术的最后一步，它的目的是从转化后的细菌中筛选出含有目标基因的克隆。
DNA重组技术的基本步骤
基因枪法又称微弹轰击法,是利用压缩气体产生的 动力,将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体 细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法.
3花粉通道法
我国转 基因抗 虫棉就 是用这 种方法
获得
植物花粉在柱头上萌发后,花粉管要穿过花柱直通胚囊. 花粉管通道法就是在植物受粉后,花粉形成的花粉管还未 愈合前,剪去柱头,然后,滴加DNA含目的基因,使目的基因 借助花粉管通道进入受体细胞.
目的基因
随堂闯关
1．在已知基因的核苷酸序列的情况下,获取目的基
因的最方便方法是聚合酶链反应
2、下列属于获取目的基因的方法的是
①利用mRNA反转录形成 ②从基因组中提取③从受体细胞中提取 ④利用PCR技术
⑤利用DNA转录
⑥人工合成
A.①②③⑤ B.①②⑤⑥ C.①②③④ D.①②④⑥
双链
c、延伸70℃-75℃：在Taq 酶的作用下,合成与模板互
补的_____D_N__A.链
d.重复a.b.c步骤：每重复 一次,目的基因增加一___倍
1.加热至95摄氏度的目的是使DNA中的
断裂,这一过程在细胞内是通过 解旋酶的作
用来完成的.
2.当温度降低时,引物与模板末端结合,在DNA
聚合酶的作用下,引物沿模板延伸,最后合成2
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断, 能终止mRNA的转录
RNA聚合酶:能够识别启动子上结合位点的一种 蛋白质.
RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点, 并与其结合.
转录开始后,RNA聚合酶沿DNA分子移动,并以 DNA分子的一条链为模板合成RNA.
转录完毕后,RNA链释放出来,紧接着RNA聚合 酶也从DNA模板链上脱落下来.
简述dna重组的过程
DNA重组是一个复杂的过程，涉及到多个步骤和分子机制。
以下是DNA重组的简要概述：同源重组：这是DNA重组的主要方式，它发生在姐妹染色单体之间或同源染色体之间。
当DNA双链断裂时，细胞会利用同源序列作为模板，通过碱基配对的方式修复断裂的DNA。
这种修复过程称为同源重组。
非同源末端连接：当DNA双链断裂后，细胞会利用非同源序列作为模板进行修复。
这种修复方式称为非同源末端连接。
在这个过程中，断裂的DNA末端会被酶催化形成磷酸二酯键，从而连接在一起。
DNA剪切：在某些情况下，DNA重组过程中需要将DNA片段从一个位置移动到另一个位置。
这个过程称为DNA剪切。
它涉及到DNA酶的切割和移动，以及新的连接的形成。
DNA复制：在DNA重组过程中，有时需要复制特定的DNA片段。
这个过程称为DNA复制。
它涉及到DNA聚合酶的作用，将游离的脱氧核苷酸按照模板的序列连接起来，形成新的DNA 片段。
转录和翻译：在某些情况下，DNA重组过程中需要将特定的基因表达出来。
这个过程包括转录和翻译两个步骤。
转录是指将DNA序列转化为RNA序列的过程，而翻译是指将RNA 序列转化为蛋白质的过程。
表观遗传修饰：除了DNA序列的改变外，DNA重组还可以涉及表观遗传修饰。
表观遗传修饰是指在不改变DNA序列的情况下，改变基因的表达方式和功能。
这可以通过DNA甲基化、组蛋白修饰等方式实现。
总之，DNA重组是一个复杂的过程，涉及到多个步骤和分子机制。
它对于生物体的生长发育、基因表达调控以及疾病的发生发展等方面都具有重要的意义。
在实验室研究中，人们通常利用重组技术来构建新的基因、研究基因的功能以及开发新的治疗策略等。
DNA重组实验原理及步骤
实验十 DNA重组一、实验原理外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。
DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。
即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程。
常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。
其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物。
②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。
③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。
T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应。
二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等。
2. 试剂：T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、载体DNA、外源DNA。
三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分。
10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
微生物遗传工程中的DNA重组技术实验操作指南
微生物遗传工程中的DNA重组技术实验操作指南DNA重组技术是现代生物技术中的一项核心技术，可用于修改和重组微生物的基因组。
它为我们揭示了微生物的基因功能及其在生物工程和药物开发中的应用提供了重要方法。
本文将介绍微生物遗传工程中的DNA重组技术实验操作指南。
一、准备工作1. 根据实验需要选择合适的质粒。
质粒应具有所需的基因序列和选择标记，在常见的质粒库中可以获得，如pUC19、pBR322等。
2. 购买或制备所需的酶。
常用的酶包括限制性内切酶、连接酶和酶切修复酶等。
3. 准备实验室必需的试剂和材料，如琼脂糖、琼脂糖酶、琼脂糖平板、蒸馏水等。
二、DNA提取1. 选择需要重组的基因来源，可以从天然环境中分离得到或通过其他方法获得。
2. 使用合适的提取方法提取基因组DNA或质粒DNA，并进行纯化。
3. 使用琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA的纯度和完整性。
三、DNA片段切割1. 根据设计的重组方案，使用限制性内切酶切割所需的DNA片段。
2. 选择合适的限制性内切酶，按照酶的操作说明进行酶切反应。
3. 使用琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物的大小和纯度。
四、连接DNA片段1. 准备连接反应混合液，包括酶切产物、DNA连接酶、缓冲液和ATP。
2. 进行DNA连接反应，并根据连接酶的操作说明进行反应条件的优化。
3. 将连接反应产物转化到适当的接收宿主中，如大肠杆菌。
五、筛选与鉴定1. 将转化后的细菌接种在含有适宜抗生素的琼脂糖平板上。
2. 孵育过夜后，观察是否有菌落形成。
可以根据预期的抗生素抗性选择菌落。
3. 从菌落中挑选单个克隆，进行PCR扩增，确认所需基因的存在以及连接是否成功。
4. 使用DNA测序确认连接DNA的准确性，并进行进一步的实验分析。
六、应用和进一步研究1. 经过确认的重组质粒可以用于进一步的微生物转化实验，如表达目的蛋白。
2. 可以使用其他技术对目标基因进行进一步操作，如点突变、基因敲除等。
3. 可以研究基因组中的功能基因，如启动子、终止子等。
重组dna的技术操作流程
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GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG
5 '
5 '
同尾酶生产的粘性末端的连接
5' TGATCA ACTAGT 5'
5'
GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
Bcl I
5' T ACTAG 5' 5' 5' 5' GATCA T
BamH
I 5' GATCC G G CCTAG 5 '
重组DNA技术与基因工程
1 2 3 4 5 6
重组DNA技术与基因工程的基本 概念 重组DNA技术所需的基本条件
重组DN基因在酵母中的表达
3 重组DNA技术的操作过程
切 接 转
增 检
3 重组DNA技术的操作过程
A DNA的体外重组（切与接）
5 ' 5 '
不同粘性末端的连接
5' CTGCAG GACGTC 5' 5' GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
Pst I
5' CTGCA 3' G T4-DNA pol 5' C G
BamH I
5' GATCC G Klenow G CCTAG 5 '
5 '
G 3' ACGTC
人工粘性末端的连接
5' 端 GCATG 3' C TdT C 3' GTACG dCTP
3’ 突出末
Sph I
5 ' G 3' ACGTC TdT CTGCA 3' Pst I G dGTP
GCATGCCCCCC 3' C C 3' CCCCCCGTACG
G 3' GGGGGGACGTC
CTGCAGGGGGG 3' G
退火
5' 5'
GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC GCATGCCCCCC G C GGGGGGACGTC
Pst I
Klenow
CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG CTGCAGGGGGG C G CCCCCCGTACG
T4-DNA ligase
5 ' 5 '
Pst I
5 '
切平
补平
GGATC CCTAG 5 '
5 ' T4-DNA ligase 5' 5'
G C
5' GATCC CTAGG
CGATCC GCTAGG
CGATCC GCTAGG
GGATCG CCTAGC
GGATCG CCTAGC
5 ' 5 '
人工粘性末端的连接
5' 端 G CTTAA 5' Klenow GAATT CTTAA 5' TdT 5'ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱAATTC G
同种内切酶生产的粘性末端的连接 同尾酶生产的粘性末端的连接 不同粘性末端的连接 人工粘性末端的连接 基于同源重组的体外In-Fusion连接 基于CRISPR-Cas9系统的体内切接 重组率
同种内切酶生产的粘性末端的连接
5'
GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5 ' 5' AATTC G
GAATTGGGGGG AATTC CTTAA GGGGGGTTAAG
退火
BamH I
5' 5'
BamH
I GGATCCCCCCCAAT CCTAGGGGGGGTT TC AAG GGATCCCCCCCAAT CCTAGGGGGGGTT TC AAG 5 ' 5 '
GAATTGGGGGGGA CTTAACCCCCCCTAG TCC G GAATTGGGGGGGA CTTAACCCCCCCTAG TCC G
5’ 突出末
EcoR I
5 ' 5' GATCC G
补平
5' AATTC TTAAG
dGTP
Klenow
5' GATCC CTAGG TdT GATCC CCCCCCCTAGG T4-DNA ligase
BamH G CCTAG 5 I '
补平
5'
5 '
GGATC CCTAG 5 ' dCTP GGATCCCCCCC CCTAG
AAAAAAA A CA AC G T T TTTT TT T G T
TG AC
CA GT
基于同源重组的体外In-Fusion连接
每条引物外侧设计含有与载体相应末端同源的15个碱基序列
引物 引物 In-Fusion酶
载体质粒
重组质粒
PCR扩增
加入In-Fusion
37℃15 min + 50℃15 min
EcoR I
5' G CTTAA 5'
5' 5' AATTC G
退火
G AATTC CTTAA G
G CTTAA 5 '
G AATTC CTTAA G
5 '
5'
G AATTC CTTAA G
T4-DNA ligase
G AATTC CTTAA G
5 ' 5 '
5' 5'
GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG
5 '
退火
T GATCC ACTAG G T GATCC ACTAG G
5 '
G GATCA CCTAG T G GATCA CCTAG T
5 ' 5 '
T4-DNA ligase
5' 5' TGATCC ACTAGG TGATCC ACTAGG GGATCA CCTAGT GGATCA CCTAGT
转化
酶
基于CRISPR-Cas9系统的体内切接
crRNA-tracrRNA-Cas9三元靶DNA裂解原理
PAM 5’-TTATATGAACATAACTCAATTTGTAAAAAAGGGTATTGGGGAATTCATTA-3’ 非互补链 靶DNA 3’-AATATACTTGTATTGAGTTAAACATTTTTTCCCATAACCCCTTAAGTAAT-5’ 互补链 crRNA 5’-
GTTTTTTTTTT CAAAAAAAAA G AC GTTTTTTTTTT CAAAAAAAAA G AC
加热
CAAAAAAAAA GTTTTTTTTTT AC G CAAAAAAAAA GTTTTTTTTTT AC G
S1
5 ' 5 '
TTTTTTT T GT TG C A A AAAA AA A C A
人工粘性末端的连接
5' G 3' C C 3' G
平头末端
5 ' G 3' C TdT G 3' AAAAAAAAAAC C 3' G dATP CAAAAAAAAAA 3' G
TdT
dTTP
GTTTTTTTTTT 3' C C 3' TTTTTTTTTTG
退火
5' 5'
T4-DNA ligase
5 ' 5 '
5'
5'
GCATGCCCCCCTGC CGTACGGGGGGACG AG TC GCATGCCCCCCTGC CGTACGGGGGGACG AG TC
CTGCAGGGGGGCA GACGTCCCCCCGTA TGC CG CTGCAGGGGGGCA GACGTCCCCCCGTA TGC CG