认识色谱柱—反相色谱柱ppt课件
赛分科技-反相液相色谱柱
其它反相液相色谱柱采用高度可控的单分子层形成和封尾技术 高的柱间重现性 高的选择性和分离效率优异的稳定性3Bio-C8Bio-C8柱适合于肽段的指纹图谱识别，天然和人工合成多肽以及低分子量蛋白等的分离。
3Bio-C4的指纹图谱识别，天然和人工多肽以及低分子量蛋白等的分离等。
色谱柱固定相理化参数应用实例紫杉醇利福平MinutesGP-Phenyl邻苯二甲酸单酯 孟鲁司特钠咀嚼片❀ 订购信息GP-C8 Bio-C8 GP-C4Bio-C4GP-Phenyl长度x 内径 粒径（μm ）订货号 10 mm x 2.0 mm （保护柱） 3 107083-2001108083-2001109043-2001110043-2001111363-2001 30 mm x 2.1 mm 50 mm x 2.1 mm 3 3 107083-2103 107083-2105 108083-2103 108083-2105 109043-2103 109043-2105110043-2103 110043-2105 111363-2103 111363-2105 10 mm x 4.0 mm （保护柱） 3 107083-4001 108083-4001 109043-4001110043-4001 111363-4001 100 mm x 4.6 mm 150 mm x 4.6 mm 250 mm x 4.6 mm 3 3 3 107083-4610 107083-4615 107083-4625 108083-4610 108083-4615 108083-4625 109043-4610 109043-4615 109043-4625 110043-4610 110043-4615 110043-4625 111363-4610 111363-4615 111363-4625 10 mm x 2.0 mm （保护柱） 5 107085-2001 108085-2001 109045-2001110045-2001 111365-2001 30 mm x 2.1 mm 50 mm x 2.1 mm 5 5 107085-2103 107085-2105 108085-2103 108085-2105 109045-2103 109045-2105110045-2103 110045-2105 111365-2103 111365-2105 10 mm x 4.0 mm （保护柱） 5 107085-4001 108085-4001 109045-4001110045-4001 111365-4001 100 mm x 4.6 mm 150 mm x 4.6 mm 250 mm x 4.6 mm 5 5 5 107085-4610 107085-4615 107085-4625 108085-4610 108085-4615 108085-4625 109045-4610 109045-4615 109045-4625 110045-4610 110045-4615 110045-4625 111365-4610 111365-4615 111365-4625 150 mm x 10.0 mm 250 mm x 10.0 mm 5 5 107085-10015 107085-10025 108085-10015 108085-10025 109045-10015 109045-10025110045-10015 110045-10025 111365-10015 111365-10025 10 mm x 21.2 mm （保护柱） 5 107085-21201 108085-21201109045-21201110045-21201111365-21201150 mm x 21.2 mm 250 mm x 21.2 mm 5 5 107085-21215 107085-21225 108085-21215 108085-21225 109045-21215 109045-21225 110045-21215 110045-21225 111365-21215 111365-21225 150 mm x 30.0 mm 250 mm x 30.0 mm 5 5 107085-30015 107085-30025 108085-30015 108085-30025 109045-30015 109045-30025 110045-30015 110045-30025 111365-30010 111365-30025 150 mm x 10.0 mm 250 mm x 10.0 mm 10 10 107089-10015 107089-10025 108089-10015 108089-10025 109049-10015 109049-10025 110049-10015 110049-10025 111369-10015 111369-10025 150 mm x 21.2 mm 250 mm x 21.2 mm 10 10 107089-21215 107089-21225 108089-21215 108089-21225 109049-21215 109049-21225 110049-21215 110049-21225 111369-21215 111369-21225 150 mm x 30.0 mm 250 mm x 30.0 mm10 10107089-30015 107089-30025108089-30015 108089-30025109049-30015 109049-30025110049-30015 110049-30025111369-30015 111369-30025注：以上为常备规格订货信息，其它规格或特殊定制产品电询。
色谱柱介绍PPT课件
OH
R
O
Si
OH
R
侧链基团：二异丁基或二异丙基 提供空间位阻可避免硅胶在低PH 下水解、破坏。
1.PH范围：1-8 2.使用了空间位阻大的硅烷 3. 未封端
优点：可以在低PH下分析酸性、碱性 和中性组分，峰形优异。
第29页/共70页
5.不同品牌色谱柱介绍
➢ Agilent Eclipse XDB,
❖苯基柱的适用范围：
1.用于分析芳香族化合物，对这类化合物有独特的分离性。 2.可以分析小分子的肽类和蛋白。
第22页/共70页
4.常见色谱柱介绍
4.4 氰基柱
CH3
SiO2
O Si CH2 CN
3
CH3
氰基柱，既可用于正相色谱，又可用于反相色谱。其在用于正相色谱时，可使
用如正己烷的低极性流动相，在用于反相色谱时，可使用甲醇或水的强极性流
合物和非离子化合物的分离。
由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高， （硅羟基的PKa低），导致碱性化合物发生拖尾。
第4页/共70页
2.色谱柱物理性能
B 型硅胶：纯度高、酸性较弱的硅胶。 这种硅胶是以无金属的工艺制备而来，只含有微量的金属 可用于分离离子化合物和可电离的化合物，特别是碱性化和物。
第17页/共70页
❖C18柱
4.常见色谱柱介绍
SiO2
CH3
O Si CH2 CH3
17
CH3
定义：C18,简称“ODS”柱，即十八烷基键合硅胶填料。 这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成 高效液相色谱70-80%的分析任务。由于C18是长链烷基键 合相有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物 大分子有更强的适应能力，应用最为广泛。
色谱柱原理及使用ppt课件
（4）连接检测器，开启柱温达30℃～40℃，用水-有机相（90：10～ 95:5），以0.3～0.6ml/min流速冲洗4h以上。（目的是充饱和色谱柱，去 除柱内空气） （5）用水-有机相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速冲洗2h以上 [或在120min内以水-有机相（95:5→0:100）梯度变化，以0.3～ 0.6ml/min流速冲洗]→再用100%有机溶剂，以0.3～0.6ml/min流速冲洗 1h以上→最后用100%有机溶剂，以1ml/min流速冲洗1h以上。（目的是 老化色谱柱） （6）在平衡前根据水相-有机相的比例，首先调整水-有机相的比例接近流 动相水相-有机相的比例，以1ml/min流速冲洗30左右（目的是相平衡过 渡）。如果流动相中含有缓冲盐，决不可在柱老化后立即用流动相平衡， 必需先用90%以上水进行预平衡30min以上，否则，会导致缓冲盐在柱内 析出结晶，严重时会将新柱永久不可逆地损坏。
+
色谱柱原理及使用
பைடு நூலகம்
+
1.2 液相色谱柱的结构及其主要功能
液相色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤
片）、接头、螺丝（封头）与柱填料等组成。
柱管：多用不锈钢制成，若果使用时柱压不高于70 kg/cm2时， 也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。用 于柱填料的装填。 压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有
小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板。
密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成， 用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封。
柱色谱PPT课件
吸附色谱三要素－洗脱剂
极性 小
大
溶剂组合
己烷－苯 苯－乙醚 苯－乙酸已酯 氯仿－乙酸已酯 氯仿－甲醇 丙酮－水 甲醇－水
25
吸附色谱三要素－洗脱剂
层析时，如被分离的物质含有羧基或氨 基等极性强的官能团，容易发生色带扩散和 拖尾现象，为了防止这种现象达到有效分离: ❖ 在分离含有羧基的试样时，可加少量的醋 酸； ❖在分离含有氨基试样时，可加少量的氨水、 吡啶、二已胺等溶剂，以控制它们的解离， 消除拖尾，提高层析效能。
溶于层析时所用的溶剂中； 2）能保持一定量的固定相，并使流动相能自由通过，
并不改变其组成； 3）保持固定相的量应尽量多，最好能达到支持剂重
量的50％以上。
30
分配色谱三要素-支持剂和固定相
❖ 纤维素：含水量可达25％，层析用纤维素可分两 种，即天然纤维素和微晶纤维素。纤维素上有许 多羟基，易与水形成氢键而将水吸附，这种吸附 着的水分形成分配柱层析中的固定相。
31
分配色谱三要素-洗脱剂
2 溶剂（洗脱剂） 一般是根据分配层析所使用的固定相和欲分
离化合物的性质来选择溶剂。在分配层析中通常 是用水为固定相，选用与水不混溶的溶剂作为流 动相。
在实际操作中多用混合溶剂作为洗脱剂，使 用时可调整溶剂系统的组成和各组分的比例，以 获得理想的溶剂系统，并加入醋酸、氨水等弱酸、 弱碱，以防止某些被分离组分的离解。
干法装柱 将吸附剂通过漏斗形成细流，慢慢加入柱内， 同时不断敲打使之均匀。 打开下端活塞，从上端倒入洗脱剂冲柱，以排 出柱内气泡，并保留一定液面
湿法装柱
在柱中装入最初要用的洗脱剂，再倒入吸附剂， 同时打开下端活塞，使洗脱剂带动吸附剂沉降 到柱下端至完全，在吸附剂上面加少许棉花或 小片滤纸。
色谱分析—柱色谱(分析化学课件)
柱色谱应用
（五）分子排斥色谱 （size- exclusion chromatography） 原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝
胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通 过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外 ，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。
全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按 质量分离。
柱色谱应用
（三）离子交换色谱（ion-exchange chromatography） 原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应； 固定相：阴离子或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子 交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 阳离子交换：R-SO3H+M+ =R-SO3 M+H + 阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4 X+OH应用：离子、可离解的化合物、氨基酸和核酸等。
柱色谱应用
1.吸附剂 吸附剂为多孔性微粒物质。常用的有硅胶、氧化铝、聚酰胺和大孔吸附树脂等。 需满足以下条件： ❖具有较大的吸附表面和吸附中心； ❖与样品、溶剂和洗脱剂均不发生化学反应； ❖不能被溶剂或洗脱剂溶解； ❖粒度均匀，且有一定的粒度。
柱色谱应用
（1）硅胶 适用于酸性或中性物质 （2）氧化铝 碱性氧化铝 pH 9.0～10.0 适于分析碱性、中性物质 中性氧化铝 pH＞7.5 适于分析酸性碱性和中性物质 酸性氧化铝 pH 4.0～5.0 适于分析酸性、中性物质 （3）聚酰胺 氢键作用，氢键能力↑强，组分越后出柱。 注：吸附剂含水量越大，活性级别越高，吸附活性越低，吸附能力越弱。
柱色谱应用
A
B
C
D
柱色谱应用
离子色谱的色谱柱技术ppt课件
阳离子交换树脂 (接枝型)
ＣＯＯ－ ＨＰＯ３－ ＣＯＯ－ ＣＯＯ－
ＨＰＯ３－
ＣＯＯ－
ＣＯＯ－ ＨＰＯ３－
ＣＯＯ－ ＨＰＯ３－
ＣＯＯ－ ＨＰＯ３－
ＨＰＯ３－ ＣＯＯ－ ＣＯＯ－ ＨＰＯ３－
分离阴离子
Column ： IonPac AG12A / AS12A
Eluent ： 2.7mM Na2CO3
2 4 6 8 10 12 14 Retention time (min)
离子排斥法分离机理
ＳＯ３－ Ｈ＋ ＳＯ３－ Ｈ＋
Ｈ２Ｏ Ｈ２Ｏ
ＣＯＯ－ Ｈ＋
固定相
ＳＯ３－ Ｈ＋
Ｈ２Ｏ Ｈ＋ Ｃｌ－
流动相
２Ｈ＋（ＣＯＯ－）２
ＣＯＯ－ Ｈ＋
Ｈ２Ｏ
（ＣＯＯＨ）２
ＳＯ３－ Ｈ２Ｏ ＳＯ３－ Ｈ＋ Ｈ２Ｏ
Ｈ＋ ＣＨ３ＣＯＯ－
交换容量 (meq; 4 x 250色谱柱) 65 120 225
16072
各类阴离子柱固定相的性质
色谱柱
乳胶或 交换容量 接枝 (每4 mm色谱柱)
功能基
IonPac® AS4A-SC L 20 meq
季铵烷醇
IonPac AS9-SC L 30-35 meq
季铵烷
IonPac AS9-HC L 190 meq
5 µS
0 0
离子排斥法分离有机酸
3 2
4 1
Column ： IonPac ICE AS1 Eluent ： 0.4 mM Octonesulfonic acid Flow rate ： 1.0 mL/min Suppressor ： AMMS-ICEⅡ Regenerator liquid ：
色谱柱介绍课件
5.不同品牌色谱柱介绍
Agilent Eclipse XDB,
Si O O O Si CH 3 Si CH 3
1.致密键合了二甲基烷基硅烷 2. 双封端 3.PH范围：2-9 优点：可以在中等PH下分析酸性、碱性 和中性组分，峰形优异，柱Hale Waihona Puke 命长.5.不同品牌色谱柱介绍
Agilent Bonus-RP,
4.常见色谱柱介绍
使用氰基柱注意事项：
1.同一根氰基柱最好在同一种体系中使用，交替调换正相、反相 会迅速缩短色谱柱的使用寿命。 2.在不得已情况下要正相、反相调换时，需要用异丙醇过渡。
4.常见色谱柱介绍
4.4 氨基柱
O
SiO2
O
Si O
CH 2
3
NH 2
氰基柱的特点： 1.氨基柱是一种不太稳定的柱子，并不是常用柱， 这是因为键合的氨丙基很容易水解。 2.正相、反相都可以使用。
4.苯基柱是分离、分析同时含极性和非极性复杂混合物的最佳选择
苯基柱的适用范围：
1.用于分析芳香族化合物，对这类化合物有独特的分离性。 2.可以分析小分子的肽类和蛋白。
4.常见色谱柱介绍
4.4 氰基柱
CH 3
SiO2
O
Si CH 3
CH 2
CN
3
氰基柱，既可用于正相色谱，又可用于反相色谱。其在用于正相色谱时，可使 用如正己烷的低极性流动相，在用于反相色谱时，可使用甲醇或水的强极性流 动相。 CN的亲脂性在反相色谱固定相中相对较低，并且由于具有π-电子作用 腈基，其与ODS相比显示出不同的选择性。适用于在ODS上分离时间太长的组
定义：是指填料颗粒的孔或腔的平均尺寸，范围80-300Å
常用液相色谱柱原理及使用与维护保养PPT
优化方法
2
流动相浓可最大化柱的分离效率。
3
其他因素
流动相配比、pH、缓冲剂的选择和添加 等因素对柱的影响合理控制以保证柱的 寿命和效能。
液相色谱柱的使用注意事项
避光
溶剂、样品和固定相种类不同、pH值不同时，柱的影响因素也不同。
柱后系统
在固定相的保护下避免混杂污染，需要定期清洗、维护流动相使其稳定。
常见的液相色谱柱材料
C1 8固定相
极佳的耐水性和极性选择性， 强了解对齐作用，能保留并分 离大部分非极性化合物。
C8固定相
与C18固定相类似，但对一些极 性化合物有更强的亲和力。
C4固定相
针对较为极性的化合物进行的 分离，一般用于富集和预分离。
液相色谱柱的选择与优化
1
选柱原则
分析物性质、柱材选用、固定相浓度、
样品处理
避免样品中有颗粒物、化合物堵塞缓冲期、流量计、检测器等器件。
液相色谱柱的维护保养方法
1
固定相的重新平衡
柱使用一段时间之后，固定相会逐渐老
流动相的定期更换
2
化，出现问题时，需要进行反相和正相 清洗。
某些流动相在特定条件下会出现化学变
化，影响柱的使用寿命。
3
柱的收纳和储存注意事项
需要在避光、低湿度、适温、无异味的 环境下进行柱的存储。
常见的色谱柱问题和解决方案
柱子变脏
提示柱子可能有混杂物污染，可 以考虑使用反相柱或者…
柱子漏液
可能是管接口关系不太紧密或者 管道盲板故障，可以检查密封情 况。
柱子分离效率低
建议从固定相性质、流动相配比、 检测器选择等多方面考虑优化。
离子交换柱
离子柱是选择性分离离子混合 物的有用工具。
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“两相分配，相似相溶”
1
色谱柱结构
色谱柱有方向性，主要与装填技术有关。 筛板的内部孔形态会影响柱效
2
规格
Waters XBridge Shield RP 18 4.6*250mm 5um
• 表观规格：柱管材质，填料分类，尺寸，粒径 • 隐藏信息：碳载量，平均孔径，比表面积，封端，键合类型，pH
H3C H
N
+
CH3
屏蔽了带负 电的硅羟基
▪改善与水的浸润性－100%水溶液兼容
▪降低了碱性化合物的保留
▪降低了拖尾现象
14
碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基呈 中性(未解离)
O- Si O- Si OH O- Si
O- Si OH
O- Si OH O- Si O- Si O- Si OH O- Si O- Si
0.00
2.00
4.00
6.00
M inutes
nortriptyline
pH 7.0
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 M inutes
8.00 10.00
amitriptyline
6.00 7.00 8.00
16
封端
常用封尾end-capped ：三 甲基硅氧烷
极性封尾，增加极性保留
• 因嵌入硅甲基的阻挡, 颗粒表面溶解速
度明显减缓
• 柱寿命大大延长
•pH范围可达1~11
8
键合
单、双、三官能团键合 三官能团键合 二官能团键合
单官能团键合
键合密度
• 碳载量 •影响残留硅羟基比率 • 键合相流失率
9
常见键合相
主要作用机 疏水 疏水 π-π 疏 氢键
理
疏水 水 π-π
氢键
氢键
阳离子 阴离子 交换 交换
由于空间位阻的存在，键合反应最多 只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅 羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发 生离子交换作用，增加了保留，导致 峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基 氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减 小这种影响，这种操作被称为封尾， 封端，封口。
17
封端
18
封端
–封口残余硅羟基 –减少不可逆吸附或拖尾 –增加碳含量（0.1% -1%）
10
空间位阻
• 空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷 • 增加pH范围，但有限，一般1~9
• Agilent • Phenomenex
11
空间位阻
• 抗水解
Agilent XDB
12
ห้องสมุดไป่ตู้性嵌入
Waters “Shield”
13
内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理
极性基团增加了表面层水的浓度
水 “屏蔽” 层
HILIC柱
Zic-HILIC Hypersil GOLD HILIC Atlantis HILIC 柱
目的：提高极性化合物 保留
宽pH色谱柱
ECOSIL ODS-Extend Xbridge/Xterra C18/C8 Gemini C18 Zorbax Extend
目的：提高色谱柱pH使 用范围
宽pH 柱
突破硅胶柱应用禁区的有力手段
Base
对碱性化合
物的保留及 严重拖尾
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
15
既然pH< 3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有 情况下采用酸性条件进行分离?
低pH可导致分离选择性的丧失!---碱性基团离子化，极性增加
AU
AU
0.04
pH 2.0
0.02
0.00 0.00
0.04 0.03 0.02 0.01 0.00
阿莫西林
“湿润时”
“去湿后”
0
2
4
6
8
Vo：被分析物没有保留
▪此时色谱柱并没有“坏”，如何复原： –低比例有机相低流速冲洗过渡，然后高比例低流速。
10 分
22
疏水塌陷
极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生
▪内嵌极性基团键合相： –使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定
保留时间无变化
流动相：0.1% 醋酸水溶液
Base
双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作
用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
H+N
(CH
3
)
2
O- Si
O- Si O-
离子交换作用
O- Si
O- Si
O-
OO
S-i
(CH
3)2H+N
O- Si
O- Si
O- Si OO-- Si O- Si
当流动相为 pH68时, 硅醇基带负
电性(大部解离)
范围，最大耐压，筛板孔径等
内径 长度
粒径 碳载量 孔径 比表面积
材质 封端
柱效 拖尾 载样量（体积） 载样量（浓度） 分离度 回收率
你能正确连接它们吗？
3
填料
• 硅胶 等载体 （正相色谱） • 硅胶+键合相 （反相色谱） • 聚合物+键合相 （离子交换，手性色谱柱等） • 整体柱 （空间排阻色谱等）
20
疏水塌陷
什么是“疏水塌陷”？
低比例有机溶剂或纯 水溶液流动相
湿润的孔
C18 硅胶
未湿润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色 谱表面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记 住：几乎所有的表面积都在孔内！
21
疏水塌陷
流动相：0.1% 醋酸水溶液
19
现代色谱柱三大技术平台
纯硅胶柱
ECOSIL ODS-SH Purospher STAR RP18e Symmetry C18
极性嵌入柱
ECOSIL ODS-EPS Zorbax-Bonus RP18 Symmetry shield RP18
目的：改善峰形
亲水AQ柱
ECOSIL ODS-AQ Atlantis Dc18, T3 Synergi Hydro-RP
4
反相色谱C18填料
5
硅胶
注意： • 硅胶 颗粒大小分布 • 金属残留 • 内部孔径 • 实心核颗粒
6
改性硅胶
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
四乙氧基硅烷 (TEOS)
甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS)
7
碱性条件下硅胶溶解
普通硅胶柱
waters改性硅胶柱
• 硅胶快速溶解 • 严重的柱失效 • 柱寿命短暂
阿莫西林 初始时
停流速后 (孔去湿: ~3%)
0
2
4
6
8
10
Minutes
23
AQ 柱
1、极性封尾 2、极性嵌入 3、低碳载量 4、保留硅羟基 5、增加极性嵌入键合相
极性保留机理：离子交换+疏水作用
▪ 对极性与非极性化合物的优异保留特性 ▪ 在100％水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定 ▪ 峰形优异 ▪ 超低键合相流失，质谱兼容 ▪ 酸性条件下稳定性良好 ▪ 在高水相、低pH条件下具有较长的色谱柱寿命 ▪ 极佳的色谱柱间重现性 ▪ 碳载量低，不适合分离复杂组份和强碱性化合物