抗体检测技术课件
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医学免疫学免疫学检测技术ppt课件
14
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
12
免疫荧光法
13
2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
22
（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
双抗体夹心法、间接法ELISA
15
间接法ELISA
16
ELISA操作图
可调移液器
8孔道可调移液器 17
3. 放射免疫测定（RIA）
常用 125I，测定微量物质 4. 化学发光免疫分析
常用 鲁米诺，测定超微量物质 5. 免疫印迹法（Western Blotting）
先做凝胶电泳将蛋白质分区 再将蛋白质转移至固相载体 后用酶免疫、放射免疫等技术加以测定
1. 免疫荧光法（IFA ）
荧光素可双色；使免疫复合物呈荧光；可定性、定位
（1）直接荧光法 荧光素一抗 对每种抗体作标记 特异 测Ag
（2）间接荧光法： 荧光素二抗 不必标记每种抗体 敏感 测Ag/Ab
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免疫荧光法
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2. 酶免疫测定（EIA）: ELISA与酶免疫组化
（1）双抗体夹心法ELISA：查抗原
10
II ) Precipitation （二）沉淀反应
可溶性抗原 + 相应抗体肉眼可见的沉淀物 使用半固体琼脂凝胶为介质——琼脂扩散/免疫扩散
1. 单向免疫扩散：抗原 的定量（Ig、C3 ）
2. 双向免疫扩散：抗原/抗体的定性、组成及Ag相关性分析 3. 免疫电泳： 电泳 + 双向免疫扩散 （抗原分析）
21
3. 细胞因子检测
（1）免疫学检测法—— 夹心法ELISA FCM
（2）生物学检测法—— 细胞增殖（或细胞增殖抑制）试验 细胞毒（或细胞毒抑制）试验
（3） 分子生物学检测法 RT-PCR测定mRNA
4. 皮肤试验： 测试IV型超敏反应能力
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（二）B细胞功能测定
1. B细胞增殖试验 小鼠：LPS 人： SPA；抗IgM
自身免疫病的相关抗体检测ppt课件
42
抗组织转谷氨酰胺转移酶抗体
组织型谷氨酰胺转移酶(fTG)广泛存在于多 种组织及细胞中，参与细胞增长、分化、受 体介导的胞吞作用、粘连、伸展及细胞的损 伤修复和凋亡，是乳糜泻患者主要的自身抗 原，为抗肌内膜抗体所识别。
乳糜泻与组织型谷氨酰胺转移酶IgG和 IgA抗体密切相关。
抗tTG抗体在检测乳糜泻患者中具有较 高的特异性和敏感性。
36
抗髓过氧化物酶抗体
是p—ANCA的主要靶抗原。
在特发性肾小球肾炎(坏死性新月体型肾小球肾炎)中 的阳性率为65％。
变应性肉芽肿性脉管炎阳性率60％，显微镜下多血 管炎45％，韦格纳肉芽肿性血管炎阳性率1 0％。
抗体的浓度与病情活动性相关，用于病情判断。
抗蛋白酶3抗体
蛋白酶3是c—ANCA的主要靶抗原，约占c—ANCA 的80％～90％。
4
（二）自身抗体的分类：
1 根据亚细胞定位
◆抗核抗体
◆抗胞浆抗体
◆抗胞膜抗体
◆抗细胞外可溶性分子抗体
2 根据有无器官/组织/细胞特异
◆非器官/组织/细胞特异自身抗体
◆器官/组织/细胞特异自身抗体
5
二、类风湿因子（Rheumatiod factor，RF）
类风关是临床上最常见的一种风湿性疾病，是以慢 性进行性关节病变为主的全身性自身免疫病，男女 发病率约为1：3。全世界患病率约1％，我国患病 率为0.3％～0.6％ 。 类风湿因子是变性IgG刺激机体产生的自身抗体,因 最先在类风湿性关节炎的血清中发现而命名，主要 为IgM型抗体，也有IgG、IgA、IgD、IgE型。
2
（二）自身免疫病的临床特征
l 患者以女性多见，发病率随年龄增长而增高，并 有遗传倾向；
抗组织转谷氨酰胺转移酶抗体
组织型谷氨酰胺转移酶(fTG)广泛存在于多 种组织及细胞中，参与细胞增长、分化、受 体介导的胞吞作用、粘连、伸展及细胞的损 伤修复和凋亡，是乳糜泻患者主要的自身抗 原，为抗肌内膜抗体所识别。
乳糜泻与组织型谷氨酰胺转移酶IgG和 IgA抗体密切相关。
抗tTG抗体在检测乳糜泻患者中具有较 高的特异性和敏感性。
36
抗髓过氧化物酶抗体
是p—ANCA的主要靶抗原。
在特发性肾小球肾炎(坏死性新月体型肾小球肾炎)中 的阳性率为65％。
变应性肉芽肿性脉管炎阳性率60％，显微镜下多血 管炎45％，韦格纳肉芽肿性血管炎阳性率1 0％。
抗体的浓度与病情活动性相关，用于病情判断。
抗蛋白酶3抗体
蛋白酶3是c—ANCA的主要靶抗原，约占c—ANCA 的80％～90％。
4
（二）自身抗体的分类：
1 根据亚细胞定位
◆抗核抗体
◆抗胞浆抗体
◆抗胞膜抗体
◆抗细胞外可溶性分子抗体
2 根据有无器官/组织/细胞特异
◆非器官/组织/细胞特异自身抗体
◆器官/组织/细胞特异自身抗体
5
二、类风湿因子（Rheumatiod factor，RF）
类风关是临床上最常见的一种风湿性疾病，是以慢 性进行性关节病变为主的全身性自身免疫病，男女 发病率约为1：3。全世界患病率约1％，我国患病 率为0.3％～0.6％ 。 类风湿因子是变性IgG刺激机体产生的自身抗体,因 最先在类风湿性关节炎的血清中发现而命名，主要 为IgM型抗体，也有IgG、IgA、IgD、IgE型。
2
（二）自身免疫病的临床特征
l 患者以女性多见，发病率随年龄增长而增高，并 有遗传倾向；
应用生物化学-抗体技术PPT课件
抗体技术的挑战
抗体生产成本高
01
由于抗体的大规模生产需要大量的细胞培养和纯化过程，因此
生产成本较高，限制了抗体的广泛应用。
抗体特异性问题
02
抗体的特异性是影响其应用的关键因素之一，如何提高抗体的
特异性是当前面临的重要挑战。
抗体稳定性不足
03
一些抗体在存储和运输过程中容易失去活性，影响其应用效果。
抗体技术的发展前景
生物制药
药物研发
抗体作为药物载体，可以用于药 物的定向输送，提高药物的疗效
和降低副作用。
免疫检测试剂
抗体可以用于制备免疫检测试剂， 如酶联免疫吸附试验（ELISA）、 免疫荧光等，用于检测生物体内
的物质。
单克隆抗体药物
利用杂交瘤技术制备的单克隆抗 体药物，具有高度特异性、低毒 性和长效性等特点，已广泛应用 于肿瘤、自身免疫性疾病等领域。
应用生物化学-抗体技术PPT 课件
• 引言 • 抗体的产生与种类 • 抗体技术的原理与流程 • 抗体技术的应用实例 • 抗体技术的挑战与前景 • 结论
01
引言
抗体的定义与特性
抗体
指免疫系统产生的一种蛋白质， 能够特异识别并结合抗原，发挥 免疫效应。
特性
高度特异性、结合力强、种类多 样。
抗体技术的历史与发展
历史
自19世纪末发现抗体以来，抗体技 术不断发展，经历了免疫学、单克隆 抗体技术、基因工程抗体等阶段。
发展
目前抗体技术已广泛应用于生物医药 、诊断、治疗等领域，为人类健康和 疾病治疗做出了巨大贡献。
抗体技术的应用领域
01
02
03
生物医药
用于药物研发、疾病诊断 和治疗，如肿瘤免疫治疗、 自身免疫性疾病治疗等。
艾滋病抗体检测技术ppt课件
Organization of the HIV-1 Virion
p24 Core Ag p ro te a s e
p31 integrase
p17 M atrix p 7 -g a g p 9 -g a g
学习交流PPT
6
Human immunodeficiency virus
HIV
HIV-1 （有A～J，O1～O4 多个亚型）
（7）负责对开展自愿咨询检测工作的艾滋病检测实验室的技术支持
和指导。
学习交流PPT
16
艾滋病确证实验室职能
（1）承担当地卫生行政部门指定的艾滋病病毒抗体确证、 抗体筛查和其他艾滋病检测工作。
• 7、组织全国艾滋病检测相关业务培训，组织制定和修改与艾滋病检测 工作有关的技术规范和指南。
学习交流PPT
15
艾滋病确证中心实验室职能
（1）负责职责范围内艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和 评价，组织艾滋病检测实验室人员技术培训。
（2）建立艾滋病检测实验室质量控制体系，组织省级实验室能力验 证和艾滋病诊断试剂的临床质量评估。
学习交流PPT
10
HIV感染以后的血清学动态
急性期 HIV RNA
Anti-Ag
潜伏期 Anti-Ab
艾滋病期
Anti-gp41/120 (anti-gp36)1周 2周 3周 4周………………….1年 2年 3年…………….10年………..
窗口期
学习交流PPT
11
窗口期: 从机体感染HIV到产生相应抗体的
Ø 1986年国际微生物学会和病毒分类学会将HTLV-Ⅲ和 LAV统称为人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus 简称HIV)
p24 Core Ag p ro te a s e
p31 integrase
p17 M atrix p 7 -g a g p 9 -g a g
学习交流PPT
6
Human immunodeficiency virus
HIV
HIV-1 （有A～J，O1～O4 多个亚型）
（7）负责对开展自愿咨询检测工作的艾滋病检测实验室的技术支持
和指导。
学习交流PPT
16
艾滋病确证实验室职能
（1）承担当地卫生行政部门指定的艾滋病病毒抗体确证、 抗体筛查和其他艾滋病检测工作。
• 7、组织全国艾滋病检测相关业务培训，组织制定和修改与艾滋病检测 工作有关的技术规范和指南。
学习交流PPT
15
艾滋病确证中心实验室职能
（1）负责职责范围内艾滋病检测实验室网络建设的业务技术指导和 评价，组织艾滋病检测实验室人员技术培训。
（2）建立艾滋病检测实验室质量控制体系，组织省级实验室能力验 证和艾滋病诊断试剂的临床质量评估。
学习交流PPT
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HIV感染以后的血清学动态
急性期 HIV RNA
Anti-Ag
潜伏期 Anti-Ab
艾滋病期
Anti-gp41/120 (anti-gp36)1周 2周 3周 4周………………….1年 2年 3年…………….10年………..
窗口期
学习交流PPT
11
窗口期: 从机体感染HIV到产生相应抗体的
Ø 1986年国际微生物学会和病毒分类学会将HTLV-Ⅲ和 LAV统称为人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus 简称HIV)
《elisa检测技术》ppt课件(2024)
拓展ELISA检测技术在生物医学、环境监测 、食品安全等领域的应用，推动相关产业的 发展。
2024/1/28
22
06 ELISA实验操作技巧与注 意事项
2024/1/28
23
实验前准备工作建议
01
仔细阅读试剂盒说明书 ，了解实验原理、操作 步骤和注意事项。
2024/1/28
02
准备好所需的试剂、耗 材和仪器，确保它们的 质量和性能符合要求。
去除异常值、缺失值等， 保证数据质量。
2024/1/28
数据转换
对数据进行对数转换、归 一化等处理，以满足后续 分析需求。
统计分析
采用t检验、方差分析等统 计方法，对实验组和对照 组数据进行比较，评估差 异显著性。
13
结果解读与报告撰写
结果解读
根据统计分析结果，结合专业知 识对实验数据进行解读，如判断 样品中目标物质的含量是否超标
《elisa检测技术》ppt课件
2024/1/28
1
目 录
2024/1/28
• ELISA检测技术概述 • ELISA实验方法与步骤 • ELISA实验数据分析与解读 • ELISA技术在生物医学领域应用 • ELISA技术挑战与发展趋势 • ELISA实验操作技巧与注意事项
2
01 ELISA检测技术概述
发展多重ELISA检测技术，实现对多个目标物的同时检测，提高检 测效率。
20
新型ELISA技术发展趋势
数字化ELISA
利用微流控、微阵列等技术，实现ELISA检测的数字化、自 动化和智能化。
免疫荧光ELISA
结合免疫荧光技术，提高ELISA检测的灵敏度和特异性。
化学发光ELISA
《自身抗体的检测》PPT课件
抗肝肾微粒体抗体（LKM）
有三种荧光模式： LKM-1：肝细胞胞浆
明显荧光，呈细 颗粒到均质状， 肾脏近近端肾小 管有荧光。 LKM-2：门静脉周围 的肝组织荧光比 其他部位强，肾 脏近近端肾小管 有荧光。 LKM-3：肝和肾均为 阴性，灵长类睾 丸间质细胞荧光 明显。
抗SSA／SSB抗体
自身抗原：SSA抗原是一个小核糖核蛋白，由 一个RNA分子和两种不同的蛋白质组成。蛋白 质的分子量为52KD和60KD。抗体直接针对蛋白 质的抗原决定簇。SSB抗原是分子量为48kD的 磷酸化蛋白。
临床意义；最常见于干燥综合征（SS）,也见于 SLE、原发性胆汁性肝硬化（PBC），偶见于慢 活肝。抗SSA抗体在新生儿红斑狼疮的发生率 几乎为100%。
临床意义：见于自身免疫性肝炎、PBC、 酒精性肝硬化。
抗角蛋白抗体（AKA）
荧光模式： 大鼠食管，
仅限于上 皮角质层 的较强的 线性分层 的均质荧 光。
抗角蛋白抗体（AKA）
自身抗原：丝聚蛋白（filaggrin）为AKA 的靶抗原。
临床意义：见于RA，阳性率36~59%，特 异性95~99%。还是一个潜在的预后标志， 高抗体滴度可能预示着较严重的RA类型。
胞浆纤维型 细纤维---波形蛋白抗体 环状纤维---原肌球蛋白抗体 针状纤维---肌动蛋白抗体
抗核糖体抗体
荧光模式： Hep-2：胞浆细
颗粒到均质 状、非常致 密的荧光 。 肝组织片：岛 状荧光。 临床意义：SLE 的特异性抗 体，与精神 症状有关。
抗Jo-1抗体
荧光模式： Hep-2：胞浆颗
ANA测定原理和方法：
间接免疫荧光法（IIF):现多以Hep-2细胞（人喉癌 上皮细胞）为底物（Ag)，其以核质丰富而极大地 提高了ANA检测的阳性率和滴度。
自身抗体检测及应用PPT课件
细胞核 细胞浆
均质型 核糖体型 斑点型 线粒体型 核仁型 高尔基体型 着丝点型 溶酶体型 周边型 颗粒型 核点型(dots)
细胞骨架
细胞周期
肌蛋白型
中心体型
波形纤维蛋白型 纺缍体型
细胞角蛋白型 纺缍丝型
原肌球蛋白型 中间体型
纽带蛋白型 结蛋白(桥粒)型
PCNA型
-
斑17点型（nRNP/Sm）
斑点型（SSA/SSB）
7 100 5~10 10
-
46 原发性胆汁性肝硬化(PBC)
抗原类型
线粒体2型（M2） 线粒体4型（M4） 线粒体8型（M8） 线粒体9型（M9） 核点 板层素
阳性率（%）
95 55 55 35~85 30 2
-
47
问题
怀疑SLE，怎么办？
-
48
常规检测程序
+ 免疫球蛋白、
补体等检测
ANA筛选
31
（pANCA）
主要见于炎症性肠病（溃疡性结肠炎和ห้องสมุดไป่ตู้罗恩病）
胞- 浆型抗中性粒细胞胞浆抗体
32
(cANCA)
主要见于Wegener’s肉芽肿及微小多动脉炎
-
ANCA临床应用
蛋33白酶3（PR3）与Wegener’s肉芽肿（WG）密切相关。
仅cANCA诊断WG的特异性大于90%，联合PR3
可超过95%， 活动期几乎100%阳性。
高滴度的抗U1-nRNP为MCTD 的特征。抗Sm抗体对SLE具有高度特 异性。
抗SSA最常出现于SS及新生儿红 斑狼疮 （100%）。抗SSB抗体几乎仅 见于女性，可出现于SS和SLE。
-
均质型
18
ELISA检测抗体ppt课件
抗体水平（ELISA后续步骤）
※重点实验※(写实验报告）
ppt课件.
2
成绩
◦ 课堂表现及出勤情况，占5分 ◦ 实验报告，占10分 ◦ 期末考试，占10分
ppt课件.
3
复习第一次课操作
SRBC冻融稀释（得到比例适当的抗原，非完整的红细胞）
↓
每孔加包被液（碳酸盐缓冲液，含抗原）100μl, 37℃ 1h （包被）
4 加完后统一放入37度温箱1h(大于1h)。
加入酶（HRP）标记二抗
ppt课件.
9
加入底物-酶促反应-反应终止
1 弃液 2 用PBS洗板7次，200μl/每孔，每次一分钟以上，
水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸 拍板，拍干。
3 于8个ELISA孔中分别加入底物100μl/每孔。 4 加完后，室温避光反应10min。 5 反应10min后，于8个ELISA孔中分别加入终止
该法敏感性强，非特异着色浅，背景清晰，因此 把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提 高ELISA的敏感度。
酶免疫测定技术
ppt课件.
20
是把放射性核素测定和抗原、抗体间的免疫化学 反应两种方法结合起来所形成的一种超微量物质 的测定方法。将抗原抗体反应的特异性与同位素 测定技术的敏感性相结合的一项新技术，具有特 异性强、目前为止灵敏度最高、准确性和精密度 好等优点。而且操作简便、易于标准化，其灵敏 度较高，可达10-9-10-12g水平,是其他分析方法所 无法比拟的。
ppt课件.
7
ELISA步骤 包被
↓ 封闭
↓ 加入待测样本
↓ 加入酶标二抗
↓ 加入底物
↓ 加入终止液，终止反应
ppt课件.
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➢抗体检测技术
免疫酶技术 免疫荧光技术 凝集反应 沉淀反应 补体结合试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定
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凝集反应
实验原理
ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的 高度敏感性检测抗原或抗体 1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其 免疫活性 2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这 种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的 活性 3. 按一定步骤进行抗原抗体反应 4. 加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量 分析
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉 淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧 有多条，彼此互不干扰。
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酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)
Enzyme linked immunosorbent assay
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直接法： 此法用于未知抗原的检测，将未知待测抗原吸附于固相载体，加入已知酶标针对特定抗原的 抗体。 间接法： 此法用于未知抗体的检测，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之 结合，洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合， 洗涤后，加入酶标抗体和底物进行测定。 双夹心间接法 此法常用于测定抗体，将已知抗原（捕获抗体的抗原）吸附于固相载体，加入待检标本（含 相应抗体）与之结合，洗涤后，加入特异性抗抗体，洗涤，再加入抗抗体特异性的酶标抗体 和底物进行测定。
以消除非特异吸附的干扰
㈡ 酶结合物： 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳
定、来源丰富、标记后稳定
2. 常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 底物：
HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光
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方法类型
ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试 剂来源、标本性状以及检测的具体条件， 可设计出不同类型的检测方法：
1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法
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HRP不可溶性底物及呈色： DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚： 灰蓝色
AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)： 荧光
AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
色后，测20孔的OD，要求CV<10%
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
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2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反 应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的 细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一 定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为 凝集原，抗体称为凝集素。
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沉淀反应
1、絮状沉淀反应 2、环状沉淀反应 3、双向扩散 4、单向免疫扩散
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A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzymelinked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
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一、试剂及仪器准备
（一） 免疫吸附剂 1.固相载体
⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应
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⑵ 载体性能比较 要求：载体材料+、- 结果差别大 检测方仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的 琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝 固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入 抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体， 外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和 定性抗原。
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➢抗体检测技术
免疫酶技术 免疫荧光技术 凝集反应 沉淀反应 补体结合试验 放射免疫测定 蛋白印迹 免疫共沉淀 亲和力测定
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凝集反应
实验原理
ELISA利用了免疫反应的高度特异性和酶促反应的 高度敏感性检测抗原或抗体 1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其 免疫活性 2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这 种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的 活性 3. 按一定步骤进行抗原抗体反应 4. 加底物显色，根据颜色反应的深浅进行定性或定量 分析
抗原抗体为单一体系时，抗原浓度不同，沉 淀弧的特征不同：
抗原抗体为多体系时，出现的沉淀弧 有多条，彼此互不干扰。
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酶联免疫吸附测定实验 (ELISA)
Enzyme linked immunosorbent assay
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直接法： 此法用于未知抗原的检测，将未知待测抗原吸附于固相载体，加入已知酶标针对特定抗原的 抗体。 间接法： 此法用于未知抗体的检测，将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗体）与之 结合，洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体（酶标抗抗体）和底物进行测定。 双抗体夹心法 此法常用于测定抗原，将已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本（含相应抗原）与之结合， 洗涤后，加入酶标抗体和底物进行测定。 双夹心间接法 此法常用于测定抗体，将已知抗原（捕获抗体的抗原）吸附于固相载体，加入待检标本（含 相应抗体）与之结合，洗涤后，加入特异性抗抗体，洗涤，再加入抗抗体特异性的酶标抗体 和底物进行测定。
以消除非特异吸附的干扰
㈡ 酶结合物： 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 要求：纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳
定、来源丰富、标记后稳定
2. 常用酶：HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等
3. 底物：
HRP可溶性底物及呈色： 邻苯二胺(OPD)：橙红(492nm)；四甲基联苯胺(TMB)：蓝色(450nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA)：棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2：荧光
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方法类型
ELISA既可测抗原又可测抗体，根据试 剂来源、标本性状以及检测的具体条件， 可设计出不同类型的检测方法：
1.直接法 2.间接法 3.双抗体夹心法 4.双夹心间接法
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HRP不可溶性底物及呈色： DAB：棕黄色 α-萘酚：红色 3-氧基-9-乙基卡唑：红色 4-氯-1-萘酚： 灰蓝色
AP可溶性底物及呈色： 对硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)： 荧光
AP不可溶性底物及呈色： NBT和BCIP混合液：紫色 坚固红和萘酚ASMX混合液：红色
色后，测20孔的OD，要求CV<10%
⑶ 常用载体： 材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯 等 形状：小试管、小珠、微量反应板
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2. Ag或Ab：纯度高、效价高、结合力高
3. 免疫吸附剂(固相Ag或Ab)： 包被：将Ag或Ab固相化的过程 包被缓冲液 封闭：包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被，
凝集反应是指颗粒抗原与相应抗体结合反 应出现的可见性现象。颗粒抗原如完整的 细菌、红细胞等与相应抗体相混合，在一 定条件下出现凝集。凝集反应中抗原称为 凝集原，抗体称为凝集素。
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沉淀反应
1、絮状沉淀反应 2、环状沉淀反应 3、双向扩散 4、单向免疫扩散
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A sandwich ELISA. (1) Plate is coated with a capture antibody; (2) sample is added, and any antigen present binds to capture antibody; (3) detecting antibody is added, and binds to antigen; (4) enzymelinked secondary antibody is added, and binds to detecting antibody; (5) substrate is added, and is converted by enzyme to detectable form.
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一、试剂及仪器准备
（一） 免疫吸附剂 1.固相载体
⑴ 要求：① 吸附力强 ② 能保持Ag或Ab活性 ③ 不参与化学反应
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⑵ 载体性能比较 要求：载体材料+、- 结果差别大 检测方仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
双向扩散法的操作：生理盐水配制1%-5%的 琼脂，取4mL倒在显微镜用的载玻片上，凝 固后打孔，中心孔滴入抗原，外周孔滴入 抗体用于测定抗体效价，中心孔滴入抗体， 外周孔滴入抗原，用于检测抗原的存在和 定性抗原。
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