DNA甲基化检测 ppt课件
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(３） Total input DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物 进行 qPCR检测得到 Ct值(Input）。ChIP DNA样品作为模板， 用待测基因特异性引物进行 qPCR检测得到 Ct值(ChIP ）。样 品 ＤＮＡ 甲基化相对量（ChIP/Total input）通过以下公式计 算: ChIP/Total input=2^ [Ct(Input)-Ct(ChIP)] 通过结果可见脊髓损伤后,大鼠腓肠肌 eif5a基因 DNA甲基 化水平降低。此结果与我们之前得到的 eif5a在脊髓损伤大鼠 腓肠肌中高表达结果相吻合(图8-3）。
甲基化 DNA免疫沉淀法是一种高效富集甲基化 DNA的方法 ꎮ。在该方法中，可与 5mC特异性结合的抗体加入到变性的 基因组 DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀， 形成富集，通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行 大规模DNA甲基化分析。 该方法简便、特异性高，适合 DNA甲基化组学的分析。 高密度的甲基化芯片是研究全基因甲基化状态的有力工具。
单链DNA在亚硫酸氢钠存在的条件下,能有效地将未甲 基化的脱氧 胞嘧啶(C)转化为脱氧尿嘧啶(U),随后作PCR 扩 增。此过程进一步将模板上的尿嘧啶(U),进一步转化为脱氧 胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(mC)不受亚硫酸氢钠影响保 持不变。使DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的 差异，根据这种差异即可以获得目的片段的甲基化信 息.MSP法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的 DNA,然后设计针 对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR 扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳确定与引物互补的 ＤＮＡ 序列的甲基化 PPT课件 状态。
表观遗传学是一种可遗传的调节基因表达的机制。不同于 经典遗传学，表观遗传学不涉及基因序列的改变，而且表观遗 传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。 DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常 细胞功能、遗传印记、胚胎发育、染色质结构改变以及人类疾 病的发生、发展中起着重要作用。 DNA甲基化是指，在DNA甲基转移酶（DNMT)作用下以S腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，将甲基转移到DNA脱氧胞 嘧啶的第五位C，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过 程 这一过程通常发生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶，是最常见 的哺乳动物基因组DNA后天修饰。 PPT课件
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(３） Total input DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物 进行 qPCR检测得到 Ct值(Input）。ChIP DNA样品作为模板， 用待测基因特异性引物进行 qPCR检测得到 Ct值(ChIP ）。样 品 ＤＮＡ 甲基化相对量（ChIP/Total input）通过以下公式计 算: ChIP/Total input=2^ [Ct(Input)-Ct(ChIP)] 通过结果可见脊髓损伤后,大鼠腓肠肌 eif5a基因 DNA甲基 化水平降低。此结果与我们之前得到的 eif5a在脊髓损伤大鼠 腓肠肌中高表达结果相吻合(图8-3）。
甲基化 DNA免疫沉淀法是一种高效富集甲基化 DNA的方法 ꎮ。在该方法中，可与 5mC特异性结合的抗体加入到变性的 基因组 DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀， 形成富集，通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行 大规模DNA甲基化分析。 该方法简便、特异性高，适合 DNA甲基化组学的分析。 高密度的甲基化芯片是研究全基因甲基化状态的有力工具。
单链DNA在亚硫酸氢钠存在的条件下,能有效地将未甲 基化的脱氧 胞嘧啶(C)转化为脱氧尿嘧啶(U),随后作PCR 扩 增。此过程进一步将模板上的尿嘧啶(U),进一步转化为脱氧 胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(mC)不受亚硫酸氢钠影响保 持不变。使DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的 差异，根据这种差异即可以获得目的片段的甲基化信 息.MSP法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的 DNA,然后设计针 对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR 扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳确定与引物互补的 ＤＮＡ 序列的甲基化 PPT课件 状态。
表观遗传学是一种可遗传的调节基因表达的机制。不同于 经典遗传学，表观遗传学不涉及基因序列的改变，而且表观遗 传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。 DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常 细胞功能、遗传印记、胚胎发育、染色质结构改变以及人类疾 病的发生、发展中起着重要作用。 DNA甲基化是指，在DNA甲基转移酶（DNMT)作用下以S腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，将甲基转移到DNA脱氧胞 嘧啶的第五位C，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过 程 这一过程通常发生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶，是最常见 的哺乳动物基因组DNA后天修饰。 PPT课件
DNA甲基化检测
DNA甲基化的检测方法
1.DNA甲基化检测的基本原理
目前文献报道的各种DNA 甲基化分析方法均依赖于三种 基本原理，它们分别是： 甲基化敏感性限制性核酸内切酶（MSRE）分析方法 对DNA 中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化 用甲基CpG 结敏感性限制性核酸内切酶分析方法
2.2甲基化特异性PCR（MSP）
• 基本原理是当用化学试剂重亚硫酸盐处理样品时，所有未 被甲基化的胞嘧啶C将发生脱氨基作用，变为尿嘧啶U； 而甲基化的胞嘧啶则不发生改变。
• 该技术主要对CpG岛甲基化情况进行分析。甲基化和未甲 基化的样品被处理后，其碱基序列将不再相同。据此分别 设计甲基化引物和非甲基化两对引物去扩增，重硫酸盐处 理后的模板，以是否能得到相应的PCR产物确定甲基化情 况。
• 若仅能用甲基化引物得到预期的PCR产物，则该片段高度 甲基化；若仅能用非甲基化引物得到预期的PCR产物，则 该片段未发生甲基化。若两对引物均能得到阳性PCR产物， 则说明该片段部分甲基化。
技术路线
染色体DNA的 制备
染色体DNA的 亚硫酸盐处理
引物的设计
PCR扩增，得 到结果
2.3重亚硫酸盐测序
甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增（MS-MLPA）
甲基化特异性PCR（MSP）
重亚硫酸盐测序
2.1甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩
增（MS-MLPA）
这是一种基于MSRE 的分析方法，该
方法要求所检测的CpG 位点位于某 一特定的MSRE 识别序列内，如 HhaⅠ所识别的GCGC。针对该位点设 计两条探针，上游探针的3′端位于 该位点5′端1 个碱基处，下游探针 5′端位于该位点3′端1 个碱基处 。上游探针的5′端和下游探针的 3′端含有一套公用PCR 引物序列。 针对不同位点的探针长度可有不同 。将探针与模板DNA 杂交后，加入 连接酶进行连接反应，并加入相应 的MSRE 如HhaⅠ。若该位点甲基化 ，HhaⅠ不能切割， 则模板保持完 整， 随后的PCR 反应可以进行， 若未甲基化，HhaⅠ将连接反应形成 的模板DNA切割，随后的PCR 反应不 能进行。
1.DNA甲基化检测的基本原理
目前文献报道的各种DNA 甲基化分析方法均依赖于三种 基本原理，它们分别是： 甲基化敏感性限制性核酸内切酶（MSRE）分析方法 对DNA 中的胞嘧啶进行化学修饰的重亚硫酸盐转化 用甲基CpG 结敏感性限制性核酸内切酶分析方法
2.2甲基化特异性PCR（MSP）
• 基本原理是当用化学试剂重亚硫酸盐处理样品时，所有未 被甲基化的胞嘧啶C将发生脱氨基作用，变为尿嘧啶U； 而甲基化的胞嘧啶则不发生改变。
• 该技术主要对CpG岛甲基化情况进行分析。甲基化和未甲 基化的样品被处理后，其碱基序列将不再相同。据此分别 设计甲基化引物和非甲基化两对引物去扩增，重硫酸盐处 理后的模板，以是否能得到相应的PCR产物确定甲基化情 况。
• 若仅能用甲基化引物得到预期的PCR产物，则该片段高度 甲基化；若仅能用非甲基化引物得到预期的PCR产物，则 该片段未发生甲基化。若两对引物均能得到阳性PCR产物， 则说明该片段部分甲基化。
技术路线
染色体DNA的 制备
染色体DNA的 亚硫酸盐处理
引物的设计
PCR扩增，得 到结果
2.3重亚硫酸盐测序
甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩增（MS-MLPA）
甲基化特异性PCR（MSP）
重亚硫酸盐测序
2.1甲基化特异性多重连接反应依赖性探针扩
增（MS-MLPA）
这是一种基于MSRE 的分析方法，该
方法要求所检测的CpG 位点位于某 一特定的MSRE 识别序列内，如 HhaⅠ所识别的GCGC。针对该位点设 计两条探针，上游探针的3′端位于 该位点5′端1 个碱基处，下游探针 5′端位于该位点3′端1 个碱基处 。上游探针的5′端和下游探针的 3′端含有一套公用PCR 引物序列。 针对不同位点的探针长度可有不同 。将探针与模板DNA 杂交后，加入 连接酶进行连接反应，并加入相应 的MSRE 如HhaⅠ。若该位点甲基化 ，HhaⅠ不能切割， 则模板保持完 整， 随后的PCR 反应可以进行， 若未甲基化，HhaⅠ将连接反应形成 的模板DNA切割，随后的PCR 反应不 能进行。
肺泡灌洗液中DNA甲基化检测在周围型肺癌诊疗中的应用研究演示稿件
VS
详细描述
通过对周围型肺癌患者进行甲基化检测， 可以了解肿瘤细胞的甲基化状态，从而评 估患者的预后。甲基化水平较高的患者通 常预后较差，生存期较短，且容易发生复 发和转移。因此，甲基化检测可以为临床 医生提供重要的预后信息，有助于制定更 加个性化的治疗方案。
06
结论与展望
研究结论
肺泡灌洗液中DNA甲基化检测在周围型肺癌的诊断中具有较高的敏感性和 特异性，有助于早期发现肺癌。
肺泡灌洗液是周围型肺癌诊断中 常用的样本，通过支气管镜获取 。
100%
样本处理
采集的肺泡灌洗液需要进行离心 、去细胞碎片等处理，提取出上 清液用于后续检测。
80%
样本保存
处理后的样本应保存在-80℃低温 冰箱中，以保持DNA的稳定性。
检测方法与流程
检测方法
目前常用的肺泡灌洗液中DNA 甲基化检测方法包括甲基化特 异性PCR（MSP）、焦磷酸测 序（Pyrosequencing）和基 于芯片的检测技术等。
肺泡灌洗液中DNA甲基化检测 在周围型肺癌诊疗中的应用研
究
汇报人:XXX
2024-01-08
目
CONTENCT
录
• 引言 • DNA甲基化概述 • 肺泡灌洗液中DNA甲基化检测技术 • DNA甲基化检测在周围型肺癌诊疗
中的应用 • 案例分析 • 结论与展望
01
引言
研究背景
02
01
03
肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其中周围型肺癌 占比较高。
02
DNA甲基化概述
DNA甲基化定义
DNA甲基化是指在DNA序列中，CpG位点的胞嘧啶被甲基所修饰 ，形成5-甲基胞嘧啶的过程。
DNA甲基化是基因表达调控的重要机制之一，对维持细胞正常功 能和个体发育具有重要意义。
DNA甲基化与癌症PPT课件
• 细胞生长抑制因子对细胞生长的调控存在多种机 制，其中由pRb 参与的G1 / S 检测点调控尤其重
要。正常情况下：
结合 p16蛋白 CDK4 /6
阻止
CDK 复合物与 周期蛋白D结合
促使
pRb不 能磷酸化
起到抑制细胞 生长的作用
阻止细胞从G1 期进入S 期
结合
未磷酸化
E2F
的pRb
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
使p53发生蛋白 质水平的降解
MDM2 表达上升
结合p53
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• BNIP3，是一个凋亡相关因子，它定位于线粒体， 可以诱导细胞在缺氧情况下发生凋亡
BNIP3 启动子 区高甲基化
引起BNIP3 表达沉默
导致细胞逃避 缺氧时的凋亡
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
• DNA甲基化发生时：
p16 基因的启 动子区域甲基化
p16 蛋白表达 受到抑制
TGFβ生长抑制信 号通路失去作用
在丙肝病毒感染的肝细胞中，发现 了丙肝病毒的核心蛋白(core protein)可引起p16基因启动子的甲 基化，p16表达水平下降从而促进了 细胞的分裂，在丙肝诱导的肝癌中 起着重要的作用。
• 近几年的研究发现，特定基因的DNA高甲基 化在这些过程中均发挥重要作用
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细 胞发生凋亡
INK4a /ARF 基因启 动子区域的甲基化
使细胞逃离p53 引起的凋亡
使p14ARF 表达下降
（p14ARF的作用 是抑制MDM2表达）
EGCG) 在实验中均表现出了对肿瘤的抑制作用。
要。正常情况下：
结合 p16蛋白 CDK4 /6
阻止
CDK 复合物与 周期蛋白D结合
促使
pRb不 能磷酸化
起到抑制细胞 生长的作用
阻止细胞从G1 期进入S 期
结合
未磷酸化
E2F
的pRb
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
使p53发生蛋白 质水平的降解
MDM2 表达上升
结合p53
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• BNIP3，是一个凋亡相关因子，它定位于线粒体， 可以诱导细胞在缺氧情况下发生凋亡
BNIP3 启动子 区高甲基化
引起BNIP3 表达沉默
导致细胞逃避 缺氧时的凋亡
2.DNA甲基化与肿瘤细胞对生长抑制信号不敏 感机制
• DNA甲基化发生时：
p16 基因的启 动子区域甲基化
p16 蛋白表达 受到抑制
TGFβ生长抑制信 号通路失去作用
在丙肝病毒感染的肝细胞中，发现 了丙肝病毒的核心蛋白(core protein)可引起p16基因启动子的甲 基化，p16表达水平下降从而促进了 细胞的分裂，在丙肝诱导的肝癌中 起着重要的作用。
• 近几年的研究发现，特定基因的DNA高甲基 化在这些过程中均发挥重要作用
1.DNA甲基化与肿瘤细胞逃避细胞死亡机制
• p53基因是一个重要的抑癌基因，可以促使损伤细 胞发生凋亡
INK4a /ARF 基因启 动子区域的甲基化
使细胞逃离p53 引起的凋亡
使p14ARF 表达下降
（p14ARF的作用 是抑制MDM2表达）
EGCG) 在实验中均表现出了对肿瘤的抑制作用。
DNA甲基化检测方法ppt课件
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Liver and testis genomic DNA templates are PCR amplicated following
digestion with no enzyme(sham),Notl,Hhal(Hh) or McrBc.Amplication
using a second primer pair that has been designed to a sequence
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MSP法检测抑癌基因RASSF1A启动子区的甲基化
U M U M U M ladder
250 200 150 100
图 MSP检测组织切片DNA甲基化状态电泳图片
甲基化特异性PCR（MSP）结果，U为非甲基化，M为甲基化。
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灵敏度，便于分析微量检材 缺点： ①引物设计要求高； ②只能作定性研究； ③存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性； ④只能了解部分位点的甲基化状态。
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MethyLight
对MSP的产物用Taqman探针进行qPCR，从而 实现甲基化的定量分析。
优点：增加了重亚硫酸盐转化和DNA复性的质控对照
避免了电泳、酶切等操作
缺点：PCR bias
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22
应用四：结合重亚硫酸盐的限制性 内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)
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23
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
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基于限制性内切酶的工具酶
《重亚硫酸盐测序技术介绍》PPT课件
CpG岛的甲基化
CpG岛经常出现在真核生物的 house-keeping基因的调控区，在其 它地方出现时会由于CpG中的C易 被甲基化而形成5'-甲基胞嘧啶，脱 氨基后形成胸腺嘧啶，由于T本身在基因 组中是以岛的形式分布的。
基本原理
重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱 氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变， 行PCR扩增(引物设计时尽量避免有CpG，以免受甲 基化因素的影响)所需片段，则尿嘧啶全部转化成 胸腺嘧啶。最后，对PCR产物进行测序，并且与未 经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。 此方法一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目 的片段中每一个CpG位点的甲基化状态。在寻找有 意义的关键性CpG位点上，有其他方法无法比拟的 优点。
重亚硫酸氢盐直接测序技术的优缺点
优点：测序法以CpG岛两侧不含CpG点的一段序 列为引物配对区，能够同时扩增出甲基化和非甲 基化靶序列。
缺点：它的不足是耗费时间和耗资过多，至少要 测序10个以上的克隆才能获得可靠数据，需要大 量的克隆及质粒提取测序，过程较为繁琐、昂贵。 在甲基化变异细胞占少数的混杂的样品中，由于 所用链特异性PCR不是特异扩增变异靶序列，故 灵敏度较MSP差。
重亚硫酸直接测序法对启动子测序 的应用
CpG岛不仅是基因的一种标志，而且还参 与基因表达的调控和影响染色质的结构。 启动子的甲基化能抑制基因的表达。
研究证明启动子区的高甲基化导致抑癌基 因失活是人类肿瘤所具有的共同特征之一， 而且这种高甲基化是导致抑癌基因失活的 又一个机制。
酶切法同亚硫酸氢盐联合法
酶切法：限制性酶切后选用对特 异DNA片段甲 基化序列敏感的限制性内切酶(酶 切位点与甲基 化位点不重叠)进行酶切后，以待测 甲基化位点 外侧序列为扩增起始点进行PCR。该 DNA片段 若存在甲基化，将会有扩增产物出现；若 无甲 基化，则不会有任何片段扩增出现。当用甲基 化不敏感的内切酶消化产物作为PCR模板时，不 论 该部位是否甲基化都不应有片段扩出。PCR 法比 Southem法更为敏感，但只能检测甲基化敏 感的限 制性位点的CpG甲基化，且DNA必须酶 切完全，否 则会出现假阳性。
基于粪便gFOBT-FIT-DNA甲基化联合检测方法的结直肠癌早筛应用研究演示课件
联合检测方法的优势与特点
优势
联合使用gFOBT、FIT和DNA甲基化检测方法可提高结直肠癌的检出率，降低假阳性率和假阴性率， 实现更准确的早期筛查。
特点
该联合检测方法具有无创、便捷、经济等优点，适用于大规模人群的筛查。同时，通过综合分析多种 生物标志物信息，有助于提高诊断的准确性和可靠性。
03
实验设计与方法
样本来源与收集
样本来源
从合作医院或研究机构收集结直肠癌 患者和健康对照人群的粪便样本。
收集方法
使用统一的粪便收集器，确保样本的 纯净性和一致性。同时记录患者的临 床信息，如年龄、性别、病理分期等 。
实验流程与操作规范
FIT检测
应用免疫比浊法检测粪便中的隐 血，具有高灵敏度和特异性。
联合检测策略
整合gFOBT、FIT和DNA甲基化 检测结果，建立联合检测模型， 提高结直肠癌早筛的准确性和可 靠性。
2
粪便FIT检测
相比gFOBT，FIT具有更高的特异性和灵 敏度，能够更准确地检测粪便中的血红 蛋白，对结直肠癌的筛查具有更高的准 确性。
3
粪便DNA甲基化检测
该方法通过检测粪便中特定基因的甲基 化水平来判断结直肠癌的风险，具有较 高的特异性和灵敏度，且不受饮食、药 物等因素的影响。
联合检测方法的性能评估
结直肠癌早筛现状与挑战
1 2 3
现有筛查方法
目前常用的结直肠癌筛查方法包括粪便隐血试验 （gFOBT）、血清肿瘤标志物检测、结肠镜检查 等。
存在的问题
现有筛查方法存在灵敏度低、特异性差、受干扰 因素多等问题，难以满足大规模人群筛查的需求 。
挑战与机遇
随着生物技术的发展，基于生物标志物的检测方 法为结直肠癌早筛提供了新的思路和机遇。
DNA测序技术及发展PPT课件
测序技术的发展历史
双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法)
➢ 1970s 同位素标记，手工 ➢ 1980s 荧光标记，自动 ➢ 1990s 毛细管电泳
合成测序法（第二代测序）
➢ 焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454） ➢ 合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） ➢ 连接测序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD）
2. 需要样品量少
Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，能应用在 很多样品有限的实验（比如免疫沉淀、显微切割等）中。
3. 简单、快速、自动化
Genome Analyzer系统高精确度的数据。自动化的流程不减少了手工操作误差和 污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。
读出待测 序列
C T G A C T T C G A C A A
5´
3´
化学降解法程序复杂 后来逐渐被Sanger法代替 这 ２种方法都需要放射性同位素标记 操作繁琐 不能 自动化不能满足大规模测序的要求。
到了20世纪80年代末 研究人员逐渐利用荧光标记 代替同位素标记测序 产物，经过平板电泳分离 荧 光分子在激光的激发下可以发射出不同波长的荧 光 ，根 据 荧 光 信 号 可 以 确 定DNA序 列。
5´ CTGACTTCGACAAAGAA 3´未知序列的单链DNA
Klenow酶 dNTP
Sanger
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP
终 止 法
双 脱 氧
较大片段
末
端
反应混合物
凝胶电泳
ACT G
较小片段
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在研究中，科学家运用限制性界标基因组扫描技术对6号染 色体区域进行 了扫描，发现了被甲基化的TCF21基因。这个 基因，由于在肿瘤细胞中被甲基化，因此表现出沉默状态。
甲基化的生物学作用
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞 功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N -6位、胞嘧啶的N -4位、鸟嘌呤的N -7位
或胞嘧啶的C-5位等在哺乳动物DNA甲基化主要发生在基因启动子或第一外显子
中-CG-（-CpG-）二核苷酸中的C发生甲基化变成-mCG-
NH2 N
O
N
+
CH3
A
HOOCC NH HC 2 H2CHS+CH2O
(SAM)
Rapid analysis of CpG methylation patterns using RNase T1 cleavage and MALDI-TOF
甲基化新位点的寻找
限制性标记基因组扫描（RLGS） 用甲基化敏感的稀频限制性内切酶NotⅠ消化基因组DNA，甲基化位 点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化 不敏感的内切酶切割，行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并 在电泳时显带，得到RLGS图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化 的可能部位
甲基化与肿瘤 抑癌基因的甲基化与细胞周期调控（如p16INK4a, p15INK4a, Rb, p14ARF)、 DNA修复(BRCA1, MGMT)、细胞凋亡(DAPK, TMS1)、抗药 性、分化、血管生成与转移等相关联
问题与展望
DNA的甲基化涉及基因的“开”与“关”，与细胞的生长繁殖、凋亡、 细胞的重编程及肿瘤细胞的形成密切相关。但对DNA甲基化还有许多问 题没有认识清楚： 怎样提高甲基化检测的灵敏与准确度？ ❖正常组织与肿瘤组织的甲基化精细“图谱”是怎样的？2003年启动 联合 基因 甲基化的选择性（基因组织特异性表达、管家基因的启动子抑甲基化） 甲基化的调控机理 高效的甲基化治疗方法
（不需亚硫酸氢盐修饰）
特异性位点的DNA甲基化的检测 BSP和MSP法
实验举例
通过BSP和MSP 方法对于前列腺癌 DLC-1基因启动子甲基化情况进 行检测。实验方法及结果：
1在线设计MSP引物 （/methprimer/index1.html）
2 DNA Extraction
特异性位点的DNA甲基化的检测
直接测序法 Bisulfite sequencing PCR（BSP ） 甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR, MSP） 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 甲基化敏感性解链曲线分析 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法
OHOH
NH2
CH3 N
DNA甲基化酶
O
N
+
A
HOOCCHCH2CHSCH2
NH2
O
OHOH
DNA甲基化研究方法
基因组整体水平甲基化分析 特异性位点的DNA甲基化的检测 甲基化新位点的寻找
基因组整体水平甲基化分析
高效液相色谱柱（HPLC） SssI 甲基转移酶法 免疫化学法 氯乙醛法
特异性位点的DNA甲基化的检测 -亚硫酸氢盐修饰
DNA甲基化研究
张茂雷 2009.5.23
主要内容
DNA甲基化原理 DNA甲基化的研究方法 甲基化的生物学作用 问题与展望
DNA甲基化原理
•
DNA 甲基化是指生物体在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase ,DMT)
的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸(SAM) 为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过
与生物的记忆存储有密切关系 人对外界事物的记忆最终是储存到基因中而不是大脑皮层（2008年PANS)
甲基化的生物学作用
与基因C →T突变的关系 DNA 甲基化引起基因突变的机制主要是由于DMT催化反应形成。 DMT可以加快C(胞嘧啶) 和5mC 脱氨,封闭U(尿嘧啶) 的修复,并且 使U →T 改变,故DMT 促使CpG序列的C →T突变 抑癌基因p53就是一个典型的例证。50% 实体瘤病人出现p53基因 突变。突变中24% 是CpG 甲基化后脱氨引起的C→T 突变。
与胚胎发育： 胚胎发育过程中DNA甲基化动态 变化：精子和卵子是高度甲基化，受精后几个小时精子基因组发 生主动去甲基化, 卵子基因组在卵裂过程中依赖于 DNA 的复制被 动地、滞后地去甲基化, 在 8-细胞期甲基化水平降到最低点, 紧接 着在桑椹胚时又升高，女性两条XX染色体有一条是由于甲基化而 全部灭活 。DNA上的表观遗传(epigenetic)化学标记一生中都不断 变化，并且变化程度在家庭成员之间是相似的 。《美国医学协会 期刊》(JAMA) 2008.6.25 与体细胞重编程 密切相关 多能干细胞的提取物与体细胞共孵育实验 293T 细胞与多能细干 胞的提取物共孵育，可使其重编程，重新去分化为多能细胞 常家的多能细胞提取物羊胎素 的作用
3 DNA Bisulfite Treatment(Active Motif CO.,USA)
4 Bisulfite sequencing PCR
5 Methylation-Specific PCR
A
1
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
C
ห้องสมุดไป่ตู้
甲基化敏感性限制性内切酶PCR/Southern法
利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特 性(不需要亚硫酸氢盐，将DNA消化为不同大小的片段后 再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有 HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)
与基因沉默 的关系 基因的甲基化改变了基因的构型,影响DNA特异顺序与转录因子的 结合,使基因不能转录; 基因5′端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白 (methyl CG-binding p rotein)结合,阻止了转录因子与基因形成转 录复合物; DNA去甲基化为基因的表达创造了一个良好的染色质 环境，可活化基因表达 体外实验：体外转染诱导因子基因使皮肤成纤维细胞转变成iPS 细胞过程中，伴随载体编码转录因子的逐渐沉默(甲基化)
甲基化的生物学作用
DNA甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞 功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N -6位、胞嘧啶的N -4位、鸟嘌呤的N -7位
或胞嘧啶的C-5位等在哺乳动物DNA甲基化主要发生在基因启动子或第一外显子
中-CG-（-CpG-）二核苷酸中的C发生甲基化变成-mCG-
NH2 N
O
N
+
CH3
A
HOOCC NH HC 2 H2CHS+CH2O
(SAM)
Rapid analysis of CpG methylation patterns using RNase T1 cleavage and MALDI-TOF
甲基化新位点的寻找
限制性标记基因组扫描（RLGS） 用甲基化敏感的稀频限制性内切酶NotⅠ消化基因组DNA，甲基化位 点保留，标记末端、切割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化 不敏感的内切酶切割，行二维电泳，这样甲基化的部分被切割开并 在电泳时显带，得到RLGS图谱与正常对照得出缺失条带即为甲基化 的可能部位
甲基化与肿瘤 抑癌基因的甲基化与细胞周期调控（如p16INK4a, p15INK4a, Rb, p14ARF)、 DNA修复(BRCA1, MGMT)、细胞凋亡(DAPK, TMS1)、抗药 性、分化、血管生成与转移等相关联
问题与展望
DNA的甲基化涉及基因的“开”与“关”，与细胞的生长繁殖、凋亡、 细胞的重编程及肿瘤细胞的形成密切相关。但对DNA甲基化还有许多问 题没有认识清楚： 怎样提高甲基化检测的灵敏与准确度？ ❖正常组织与肿瘤组织的甲基化精细“图谱”是怎样的？2003年启动 联合 基因 甲基化的选择性（基因组织特异性表达、管家基因的启动子抑甲基化） 甲基化的调控机理 高效的甲基化治疗方法
（不需亚硫酸氢盐修饰）
特异性位点的DNA甲基化的检测 BSP和MSP法
实验举例
通过BSP和MSP 方法对于前列腺癌 DLC-1基因启动子甲基化情况进 行检测。实验方法及结果：
1在线设计MSP引物 （/methprimer/index1.html）
2 DNA Extraction
特异性位点的DNA甲基化的检测
直接测序法 Bisulfite sequencing PCR（BSP ） 甲基化特异性的PCR（methylation-specific PCR, MSP） 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸 甲基化敏感性解链曲线分析 甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法
OHOH
NH2
CH3 N
DNA甲基化酶
O
N
+
A
HOOCCHCH2CHSCH2
NH2
O
OHOH
DNA甲基化研究方法
基因组整体水平甲基化分析 特异性位点的DNA甲基化的检测 甲基化新位点的寻找
基因组整体水平甲基化分析
高效液相色谱柱（HPLC） SssI 甲基转移酶法 免疫化学法 氯乙醛法
特异性位点的DNA甲基化的检测 -亚硫酸氢盐修饰
DNA甲基化研究
张茂雷 2009.5.23
主要内容
DNA甲基化原理 DNA甲基化的研究方法 甲基化的生物学作用 问题与展望
DNA甲基化原理
•
DNA 甲基化是指生物体在DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase ,DMT)
的催化下,以s-腺苷甲硫氨酸(SAM) 为甲基供体,将甲基转移到特定的碱基上的过
与生物的记忆存储有密切关系 人对外界事物的记忆最终是储存到基因中而不是大脑皮层（2008年PANS)
甲基化的生物学作用
与基因C →T突变的关系 DNA 甲基化引起基因突变的机制主要是由于DMT催化反应形成。 DMT可以加快C(胞嘧啶) 和5mC 脱氨,封闭U(尿嘧啶) 的修复,并且 使U →T 改变,故DMT 促使CpG序列的C →T突变 抑癌基因p53就是一个典型的例证。50% 实体瘤病人出现p53基因 突变。突变中24% 是CpG 甲基化后脱氨引起的C→T 突变。
与胚胎发育： 胚胎发育过程中DNA甲基化动态 变化：精子和卵子是高度甲基化，受精后几个小时精子基因组发 生主动去甲基化, 卵子基因组在卵裂过程中依赖于 DNA 的复制被 动地、滞后地去甲基化, 在 8-细胞期甲基化水平降到最低点, 紧接 着在桑椹胚时又升高，女性两条XX染色体有一条是由于甲基化而 全部灭活 。DNA上的表观遗传(epigenetic)化学标记一生中都不断 变化，并且变化程度在家庭成员之间是相似的 。《美国医学协会 期刊》(JAMA) 2008.6.25 与体细胞重编程 密切相关 多能干细胞的提取物与体细胞共孵育实验 293T 细胞与多能细干 胞的提取物共孵育，可使其重编程，重新去分化为多能细胞 常家的多能细胞提取物羊胎素 的作用
3 DNA Bisulfite Treatment(Active Motif CO.,USA)
4 Bisulfite sequencing PCR
5 Methylation-Specific PCR
A
1
结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法
C
ห้องสมุดไป่ตู้
甲基化敏感性限制性内切酶PCR/Southern法
利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特 性(不需要亚硫酸氢盐，将DNA消化为不同大小的片段后 再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有 HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)
与基因沉默 的关系 基因的甲基化改变了基因的构型,影响DNA特异顺序与转录因子的 结合,使基因不能转录; 基因5′端调控序列甲基化后与核内甲基化CG序列结合蛋白 (methyl CG-binding p rotein)结合,阻止了转录因子与基因形成转 录复合物; DNA去甲基化为基因的表达创造了一个良好的染色质 环境，可活化基因表达 体外实验：体外转染诱导因子基因使皮肤成纤维细胞转变成iPS 细胞过程中，伴随载体编码转录因子的逐渐沉默(甲基化)