抗补体活性测定法
绵羊红细胞及补体活性对静注人免疫球蛋白(PH4)抗补体活性测定的影响
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3血清补体总活性测定
• （5）免疫调节作用：①C3可参与 捕捉固定抗原，使抗原易被APC处 理与递呈。②补体可与免疫细胞相 互作用，调节细胞的增殖与分化。 ③参与调节多种免疫细胞的功能。
补体激活的途径：
• 经典途径 • 旁路途径 • MBL途径
相同点：三条途径有共同的末端通路， 即形成膜攻击复合物溶解细胞。
1、补体经典途径(classical pathway)：是 指以抗原抗体复合物为主要刺激物，使补体 固有成分以C1、C4、C2、C3、C5～C9顺 序发生酶促连锁反应，产生一系列生物学效 应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。
• 灭活：56℃加热30min即可灭活
补体系统的生物学功能
– （1）溶菌和溶细胞作用：补体系统激活 后，在靶细胞表面形成MAC，从而导致 靶细胞溶解。
– （2）调理作用：补体激活过程中产生的 C3b、C4b、iC3b都是重要的调理素， 可结合中性粒细胞或巨噬细胞表面相应 受体，因此，在微生物细胞表面发生的 补体激活，可促进微生物与吞噬细胞的 结合，并被吞噬及杀伤。
• 2、替代途径（旁路途径）:是指不经C1、 C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因 子参与下，直接由C3b与激活物结合启动 补体酶促连锁反应，产生一系列生物学效 应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途 径。在感染早期可为机体提供有效的防御 机制。其激活物是病原微生物等提供接触 表面
• 3、MBL途径：在感染早期，体内分泌甘露 聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白。 MBL与细菌表面的甘露糖残基结合，然后 与丝氨酸蛋白酶结合形成MASP（MBL相 关的丝氨酸蛋白酶），MASP继而水解C4 和C2启动后序的酶促连锁反应，产生一系 列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的 补体活化途径。激活物（或激活剂）是炎 症期产生的蛋白和病原体。
补体含量测定实验报告
1. 学习补体活性测定的原理和方法。
2. 掌握补体活性的定量分析方法。
3. 了解补体含量在临床医学中的应用。
二、实验原理补体（Complement）是一组存在于人体血浆中的蛋白质，具有增强免疫应答、清除病原体等作用。
补体活性测定是评估机体免疫功能的重要指标之一。
本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。
三、实验材料1. 试剂：溶血素、补体标准品、生理盐水、蒸馏水、抗人球蛋白抗体、酶标仪、微量移液器、比色皿等。
2. 仪器：离心机、恒温水浴箱、显微镜、离心管等。
四、实验方法1. 标准曲线的制备（1）将补体标准品稀释成不同浓度（如1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等）。
（2）将各浓度补体标准品与等量溶血素混合，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。
（3）加入等量抗人球蛋白抗体，混匀，置于37℃水浴箱中孵育30分钟。
（4）加入生理盐水，终止反应。
（5）在酶标仪上检测各孔的吸光度（OD值）。
（6）以OD值为纵坐标，补体浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品检测（1）取一定量待测样品，按上述步骤进行稀释。
（2）重复上述步骤，检测样品的OD值。
（3）根据标准曲线，计算样品中补体的含量。
1. 标准曲线制备：根据实验数据绘制标准曲线，如图1所示。
图1 补体标准曲线2. 样品检测：根据标准曲线计算样品中补体的含量，结果如下表所示。
表1 样品补体含量检测结果样品编号补体含量（U/ml）1 32.52 27.03 24.54 20.05 16.5六、实验讨论1. 本实验采用经典途径补体活性测定方法，通过检测溶血素在补体参与下的溶血活性，间接反映补体含量。
2. 实验结果显示，样品中补体含量在16.5～32.5 U/ml之间，说明样品具有一定的补体活性。
3. 补体含量测定在临床医学中具有重要意义，如评估机体免疫功能、诊断某些疾病等。
七、实验总结1. 本实验成功制备了补体标准曲线，为后续样品检测提供了依据。
降低静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性的试验观察
降低静脉注射用人免疫球蛋白抗补体活性的试验观察常娅莉,张艳荣,赵宜为,李振平,刘 燕,崔红宇兰州生物制品研究所,兰州 730046)摘 要:采用CH50试验法测定静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)抗补体活性(ACA),在中性p H条件下,比较了不同的Na+含量及不同种类的糖对ACA测定结果的影响。
结果表明,NaC1含量由0.2%上升至1.0%时,AC A呈逐渐下降趋势;用5%葡萄糖作稳定剂时ACA最低。
IVIG在37 条件下放置一月后,AC A有明显下降趋势。
在半成品配制过程中,p H及各种成份的加入顺序对ACA也有一定影响。
关键词:静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG);抗补体活性(ACA);稳定剂中图分类号:R392.11 文献标识码:A 文章编号:1005-5673(2003)03-0037-03Study and observation on reducing ACA of human immunoglobulin for intravenous injection C HANG Ya-li,Z HANG Yan-ron g,Z HAO Yi-wei,et al. (Lan z hou Institute o f Biological products,Lanzhou730046,China)Abstract:The ACA of human immunoglobulin for intravenous injection was determined by C H50test.The effect of different Na+ contents and sugars were studied to ACA determination.The resul ts showed that ACA was reduced if the Na+content increased from0.2%to1.0%;the ACA of IVIG i s lowest when the5%glucose is used as stabilizer,and the AC A were reduced when IVIG is stored at37 for one month.During preparation of final bulk,the order of adding stabilizers also effects the result of AC A de-termination.Key words:Hu man im munoglobulin for intravenous injection(IVIG);Anticomplement Acti ve(ACA);Stabilizer静脉注射用人免疫球蛋白(IVIG)是具有多种抗体活性的血液制品,因具有广泛的应用价值而受到临床重视。
抗补体活性测定法
5.方茴说：“那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。
我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。
”6.方茴说：“我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。
”7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。
8.这些孩子都很活泼与好动，即便吃饭时也都不太老实，不少人抱着陶碗从自家出来，凑到了一起。
9.石村周围草木丰茂，猛兽众多，可守着大山，村人的食物相对来说却算不上丰盛，只是一些粗麦饼、野果以及孩子们碗中少量的肉食。
附录ⅨK抗补体活性测定法本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。
试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。
（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。
用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。
（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。
（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。
根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。
放冷后置4℃冰箱保存备用。
（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。
（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。
（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。
生化方法检测补体的原理
生化方法检测补体的原理
生化方法用于检测补体的原理是利用补体活性引发特定生化反应的能力进行测定。
补体是一组血浆蛋白，在免疫反应中发挥重要作用。
补体可以通过一系列级联反应，参与细胞毒性、炎症反应、免疫复合物溶解等过程。
补体的活性可以通过多种方法进行检测。
其中一种常用的生化方法是补体结合试验（CH50），它可以用来评估补体系统的总活性。
CH50发生在两个步骤中，首先是固定补体与溶菌素结合，然后是固定补体与抗补体抗体结合。
在这个过程中，最终形成一个结合复合物。
CH50方法中，固定补体通常是红细胞或细胞膜，在试验开始时与试样混合。
如果补体系统正常，补体会结合到细胞表面或抗原上，并引发溶菌素活化，最终形成溶菌环。
溶菌环可以通过颜色改变或光度等数值进行测定。
通过测定溶菌环的形成与消失，可以计算出补体结合能力，即CH50值。
CH50值较高表示补体系统活性较强，而较低的值则可能表示补体系统的缺陷或异常。
除了CH50方法，还有其他的生化方法来检测补体活性，如溶血试验、自溶试验等。
这些试验都利用了补体活性引发特定生化反应的原理，以评估补体系统的
功能。
免疫检验考试辅导：补体总活性测定
（一）补体总活性测定实验原理补体最主要的活性是溶细胞作用。
特异性抗体与红细胞结合后可激活补体，导致红细胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分渗入，引起红细胞肿胀而发生溶血。
补体溶血程度与补体的活性相关，但非直线关系。
在一个适当的、稳定的反应系统中，溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线。
如以溶血百分率为纵坐标，相应血清量为横坐标，可见在轻微溶血和接近完全溶血处，对补体量的变化不敏感。
S形曲线在30%～70%之间最陡，几乎呈直线，补体量的少许变动，也会造成溶血程度的较大改变，即曲线此阶段对补体量的变化非常敏感。
因此，实验常以50%溶血作为终点指标，它比100%溶血更为敏感，这一方法称为补体50%溶血实验即CH50。
考试用书（二）检测试剂绵羊红细胞；溶血素；稀释缓冲液。
（三）方法评价CH50试验是测定经典途径总补体溶血活性，所反映的是补体9种成分的综合水平。
方法简便、快速，但敏感性较低。
补体的溶血活性除与试验中反应体积成反比外，还与反应所用缓冲液的pH、离子强度、钙镁浓度、绵羊红细胞数量和反应温度有一定关系。
缓冲液pH和离子强度增高，补体活性下降，虽可稳定溶血系统，但过量则反而抑制溶血反应，故实验时对反应的各个环节应严加控制，统一步骤。
（四）临床意义CH50法检测是补体经典途径的溶血活性，所反映的主要是补体9种成分的综合水平。
如果测定值过低或者完全无活性，首先考虑补体缺陷，可分别检测C4、C2、C3和C5等成分的含量；严重肝病时血浆蛋白合成能力受损。
营养不良时蛋白合成原料不足，也可以不同程度地引起血清补体水平下降。
在患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等自身免疫病时，血清补体水平随病情发生变化。
疾病活动期补体活化过度，血清补体水平下降；病情稳定后补体水平又反应性增高。
因此补体检测常可作为自身免疫病诊断或是否有疾病活动的参考指标。
细菌感染特别是革兰阴性细菌感染时，常因补体旁路途径的活化过度引起血清补体水平降低。
实验4 补体结合反应、血清总补体活性测定(CH50法)
补体结合反应:结果观察 血清总补体活性测定(CH50法):每人操作
补体参与的反应
补体参与的反应
溶血反应 补体结合反应 血清总补体活性测定(CH50法)
溶血反应
RБайду номын сангаасC
+
抗RBC抗体 (溶血素) 新鲜血清
溶血
补体结合试验
（complement fixation test,CFT)
是根据抗原和抗体反应所形成的复合物吸附并激活补体的原理所设计的一种血清学反应。
取5%羊红细胞1毫升，1000转/分离心10分钟，弃去上清，加入蒸馏水0. 置37℃水浴, 30min 溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作为 终点观察指数最为敏感。
法、结果判定及临床意义。熟悉 ①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）
50%溶血标准管的配制： 取5%羊红细胞1毫升，1000转/分离心10分钟，弃去上清，加入蒸馏水0.
血清补体含量的计算。 有5种成分参与，分属于3个系统：
血清总补体活性测定(CH50法):每人操作 第2、3、4管为对照管应溶血，第5管为SRBC对照不应溶血。 此管的稀释度乘以5即是标本的每毫升补体含量。 ①反应系统，即已知的抗原（或抗体）与待测的抗体（或抗原）
溶血程度与血清中补体量相关，呈一弧形曲 线，但在50%溶血（CH50）附近时，溶血度 与补体量之间呈线性关系，故以50%溶血作 为终点观察指数最为敏感。
CH50法原理
被检血清及各种试剂稀释法
管号
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH7.4 巴比妥缓冲
液(ml)
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抗补体活性测定法
本法系采用免疫溶血反应作指示系统，根据供试品消耗补体所反映出的溶血率变化，测定供试品的抗补体活性。
试剂（1）镁-钙贮备液取氯化钙1.103g、氯化镁（MgCl2·6H2O）5.083g，加水溶解并稀释至25ml。
（2）巴比妥缓冲液贮备液取氯化钠41.5g、巴比妥钠5.1g，加水800ml溶解。
用1mol/L 盐酸溶液调pH值至7.3，加镁-钙贮备液2.5ml，加水稀释至1000ml，用0.22μm膜滤过，4℃保存备用。
（3）明胶巴比妥缓冲液（GVB）取明胶0.625g，加水30ml煮沸使溶解，加巴比妥缓冲液贮备液100ml，再加水稀释至500ml，新鲜制备，当天使用。
（4）阿氏液（Alsever’s液）取枸橼酸0.5g、枸橼酸钠8.0g、葡萄糖20.5g、氯化钠4.2g，加水溶解并稀释至1000ml（pH6.2左右）。
根据一次采羊血需要量将该溶液分装于采血瓶中，116℃蒸汽灭菌10分钟（灭菌后，尽快释放蒸汽）。
放冷后置4℃冰箱保存备用。
（5）绵羊红细胞由绵羊颈静脉无菌采集全血适量，与等体积的阿氏液混合，无菌分装，4℃保存一周后方可使用。
（6）溶血素兔抗羊红细胞血清。
（7）豚鼠血清（补体）取10只以上豚鼠血清，混合，4℃离心除去血细胞，分装，-70℃保存，也可冻干保存。
豚鼠血清每1ml中的补体总活性应不低于100CH50。
5%羊红细胞悬液制备取绵羊红细胞适量，用明胶巴比妥缓冲液至少洗3次后，悬浮于适量明胶巴比妥缓冲液中。
取0.2ml红细胞悬液，加至2.8ml水中，待红细胞完全溶解后照紫外-可见分光光度法（附录ⅡA）在波长541nm处测定吸光度，根据下列公式，将该溶液的吸光度调节至0.62±0.01（每1ml红细胞悬液含红细胞1×109个）。
V f = V i×A
————
0.62
式中Vi 为稀释前红细胞悬液体积，ml；
A为稀释前红细胞溶解液吸光度；
V f为稀释后红细胞悬液体积，ml。
溶血素滴定按表1稀释溶血素。
从1∶75稀释的溶血素开始，1.0ml不同稀释度的溶血素分别与5%羊红细胞悬液1.0ml混合，37℃放置30分钟后，取0.2ml，加明胶巴比妥缓冲液1.10ml，稀释的豚鼠补体溶液（如150倍稀释补体）0.2ml，37℃放置60分钟后，以每分钟2000转离心5分钟，吸取上清液，照紫外-可见分光光度法（附录Ⅱ A）于波长541nm处测定各管吸光度。
每个稀释度做2管。
同时再做3管未溶血对照管（明胶巴比妥缓冲液1.4ml，加5%羊红细胞悬液0.1ml），3管全溶血管(水1.4ml加5%羊红细胞0.1ml)，同法操作。
按下式计算各管溶血率（Y），以Y值为纵坐标，以不同溶血素稀释度为横坐标作图，从而确定敏化羊红细胞所用的溶血素的稀释度。
选择增加溶血素的量也不影响Y值
的溶血素的稀释度，为每1ml含1个最小溶血单位（即每1ml含1MHU）。
最大溶血率应在50%～70%范围，否则试验不成立。
Y =各管吸光度-未溶血对照管吸光度
______________________________ ×100%
全溶血管吸光度-未溶血对照管吸光度
最适敏化的羊红细胞（EA）的制备量取每1ml含2MHU的溶血素（A）适量，缓慢注入等体积的5%羊红细胞（E）悬液中，37℃放置15分钟后，2～8℃保存，6小时内使用。
滴定豚鼠血清中补体活性用明胶巴比妥缓冲液适当稀释豚鼠血清，然后按表2滴定补体。
以补体用量的对数对Y/（1－Y）的对数作直线回归，从而求出直线回归方程的截距（a）、斜率（b）和相关系数（r），补体活性按下式计算
补体活性（CH50/ml）=(1/X)×(补体稀释倍数/5)
式中1/X为a值反对数的倒数。
抗补体活性测定根据测得的豚鼠血清补体活性，用明胶巴比妥缓冲液稀释成每1ml 含100CH50溶液，按表3制备培养混合物。
表3中静注人免疫球蛋白(IVIG)是按每1ml含50mg浓度计算的。
如果IVIG的浓度不是每
1ml含50mg时，则按下式计算IVIG的加量(V)。
然后再根据IVIG的实际取量计算明胶巴比妥缓冲液的加量，但要保持供试品加缓冲液的总量为0.8ml。
将此混合物在37℃放置60分钟后，取0.2ml加9.8ml明胶巴比妥缓冲液(50倍稀释)，测定剩余补体活性。
V(ml)= 10mg
________________________________
供试品每1ml中IgG含量（mg）
表3供试品及补体对照管制备
供试品管/ml 补体对照管/ml
供试品(50mg/ml) 0.2 —
明胶巴比妥缓冲液0.6 0.8
补体(100CH50/ml) 0.2 0.2
按下式计算供试品抗补体活性。
D为每1ml含80 ～120 CH50时，试验成立。
供试品抗补体活性（%）= D-G
_____ ×１００％
D
式中D为补体对照管剩余补体活性，CH50/ml；
G为供试品管剩余补体活性，CH50/ml。
【附注】（1）洗红细胞时，务必将白细胞弃掉。
（2）敏化红细胞时一定要慢慢轻摇。
（3）仅允许使用澄清明胶溶液。