多肽物质分离与分析方法研究进展
大豆球蛋白的组成多肽分离及氨基酸组分分析
大豆球蛋白的组成多肽分离及氨基酸组分分析 3
郑志雄 ,杨晓泉
(华南理工大学轻工与食品学院食物蛋白工程研究中心 ,广东 广州 , 510640)
摘 要 通过 Nagano方法制备得纯度达 95%以上的大豆球蛋白 ,以其为原料 ,通过制备型液相色谱 ,对大豆球 蛋白的组成多肽进行了分离 。结果显示 :以 DEAE2Sepharose Fast Flow为分离介质 ,以含有 6 mol/L 碳酰二胺和 0102 mol/L巯基乙醇 、pH值为 6145的 0105 mol/L 磷酸缓冲液为平衡液 ,通过对穿透液及梯度洗脱液的分部收 集 ,大豆球蛋白的组成多肽能得到较好的分离 ,回收率达到 75% ,聚丙烯酰胺凝胶电泳显示各组分的纯度达 90%。此外 ,对各组成多肽的氨基酸组分及种类进行了分析 。 关键词 大豆球蛋白 ,多肽 ,分离 ,制备型液相色谱 ,氨基酸组分分析
样品按 1∶100 ( g∶mL )溶于 6mol/L HCl,密封后 110℃水解 24 h。使用装 P ICO1TAG柱的 HPLC系统 (W aters 510,美国 )于 38℃、检测波长 254 nm、流速 110 mL /m in状态下对氨基酸组成进行测定 ,结果表 示为 g /100 g蛋白质 。
agano方法提取制得大豆球蛋白sd2page电泳图谱212大豆球蛋白肽分离纯化按照11312中的层析条件以211中大豆球蛋白为原料经离子交换色谱分离得到包含各洗脱组分的洗脱图谱见图研究结果比较本试验的洗脱峰数量多1个即最后那个nknown此外第ori等人的这可能是因为本试验上样量远远大于他们的实验2sepharosefastflow洗脱图谱分别对不同收集管的收集样品进行sd2page分析结果见图4
鉴定多肽的方法
鉴定多肽的方法鉴定多肽的方法主要包括质谱分析、高效液相色谱（HPLC）、核磁共振（NMR）技术、芯片技术以及蛋白质组学数据库和计算分析。
质谱分析是基于质谱仪器的原理，通过将多肽样品离子化并分离质量/电荷比（m/z），可以获得多肽的质量信息。
质谱分析可以用于鉴定未知多肽、测定多肽的分子量和序列，以及定量分析多肽的表达水平。
高效液相色谱是一种常用的分离和纯化方法，也可以用于多肽组学检测。
HPLC将多肽样品通过液相色谱柱进行分离，根据不同多肽的亲水性、极性和其他性质，使其在柱中具有不同的保留时间。
这种方法可以用于分离复杂多肽混合物，纯化目标多肽，并帮助进一步的分析和表征。
核磁共振技术是一种用于研究多肽结构和动力学的方法。
通过核磁共振技术，可以确定多肽的原子间距离、化学位移和偶合常数，进而推断多肽的三维结构和构象。
NMR技术在研究多肽的折叠和相互作用方面具有重要的应用。
芯片技术是一种高通量的多肽组学检测方法。
通过将大量多肽固定在芯片上的微阵列区域，可以同时检测成千上万种多肽。
这种方法可以用于筛选与特定生物过程相关的多肽、研究多肽相互作用和识别多肽标记物等。
蛋白质组学数据库和计算分析在多肽组学中起着关键作用。
这些数据库收集整理了大量的多肽和蛋白质数据，并提供了用于多肽识别、鉴定和功能预测的工具和算法。
通过与这些数据库的比对和分析，可以帮助确定多肽的来源、结构和功能。
此外，对于较复杂的多肽类药物或多肽混合物来说，需要借助专属性更强的检测技术进行鉴定，如肽质量指纹图谱（PMF）、核磁共振技术（NMR）或质谱（MS）等鉴别方法。
核磁共振光谱适用于氨基酸数目小于10的多肽样品，对于10个以上氨基酸组成的多肽，NMR数据分析会受到一定的挑战，此时可以选择鉴定范围较宽的质谱技术进行鉴别研究。
如需更多信息，建议咨询专业生物学家或查阅生物学相关论文。
多肽类药物研究进展
多肽类药物研究进展
齐烨迪;苏慧;陈莉;赖昕;余丽双
【期刊名称】《福建分析测试》
【年(卷),期】2018(027)001
【摘要】多肽类药物在临床上被广泛应用于抗肿瘤、信息传导等方面,为生物医药的发展提供了强有力的支持,但由于其结构复杂、稳定性差、易降解等原因,使得对多肽类药物进行分析存在困难.近年来,随着仪器以及技术的发展,多肽类药物的分析方法有所发展.本文主要从生物活性分析、质谱法、光谱法、色谱法等方面对多肽类药物的分析方法进行综述,并对多肽类药物的发展前景进行展望.
【总页数】6页(P23-28)
【作者】齐烨迪;苏慧;陈莉;赖昕;余丽双
【作者单位】福建中医药大学,福建福州 350100;福建中医药大学,福建福州350100;福建中医药大学,福建福州 350100;福建中医药大学,福建福州 350100;福建中医药大学,福建福州 350100
【正文语种】中文
【中图分类】R284.2
【相关文献】
1.抗心肌缺血再灌注损伤多肽类药物的研究进展 [J], 何小奇; 邓莉
2.多肽类药物防治缺血性脑卒中的研究进展 [J], 梁旭玲; 邓莉; 梁泉燕; 朱艳
3.多肽类药物防治缺血性脑卒中的研究进展 [J], 梁旭玲;邓莉;梁泉燕;朱艳
4.蛋白多肽类药物和单抗药物免疫原性评价方法及研究进展 [J], 王慧敏;闻镍;王晓霞;刘丽;刘会芳
5.蛋白及多肽类药物长效化制剂学技术研究进展 [J], 丁源;陈新;涂家生;孙春萌因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
活性多肽的实验报告
一、实验目的1. 学习活性多肽的提取方法。
2. 了解活性多肽的生物学活性及其作用。
3. 掌握活性多肽的鉴定与分析技术。
二、实验原理活性多肽是一类具有生物活性的小分子肽，由2个或2个以上氨基酸通过肽键相互连接而成。
它们在生物体内起着重要的生理调节作用，如免疫调节、细胞信号传导、生长调节等。
本实验通过提取活性多肽，对其生物学活性进行分析，探讨其在医学、食品、生物工程等领域的应用前景。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜淡水鱼、生物酶、硫酸铵、盐酸、丙酮等。
2. 实验仪器：离心机、紫外可见分光光度计、pH计、电热恒温水浴锅、分析天平等。
四、实验方法1. 活性多肽的提取（1）取新鲜淡水鱼，去内脏、去皮，切成小块。
（2）将鱼块放入酶解液中，在50℃、pH 7.0条件下酶解4小时。
（3）酶解完成后，将混合液离心（3000 r/min，20 min）取上清液。
（4）用硫酸铵对上清液进行盐析，沉淀后用丙酮洗涤，去除杂质。
（5）将沉淀物溶于适量水中，调节pH至7.0，离心（3000 r/min，20 min）取上清液，即为活性多肽溶液。
2. 活性多肽的鉴定与分析（1）紫外可见分光光度法测定活性多肽浓度。
（2）采用SDS-PAGE电泳法对活性多肽进行分离鉴定。
（3）通过体外实验检测活性多肽的生物学活性，如免疫调节、细胞信号传导、生长调节等。
五、实验结果与分析1. 活性多肽的提取通过酶解、盐析、丙酮洗涤等步骤，成功提取出活性多肽溶液。
2. 活性多肽的鉴定与分析（1）紫外可见分光光度法测定活性多肽浓度为0.5 mg/mL。
（2）SDS-PAGE电泳结果显示，活性多肽分子量分布在500-3000 Da之间。
（3）体外实验结果表明，活性多肽具有免疫调节、细胞信号传导、生长调节等生物学活性。
六、实验结论1. 成功提取出淡水鱼活性多肽，并通过紫外可见分光光度法、SDS-PAGE电泳法对其进行了鉴定。
2. 活性多肽具有免疫调节、细胞信号传导、生长调节等生物学活性，为活性多肽在医学、食品、生物工程等领域的应用提供了理论依据。
多肽药物的质量控制技术研究
多肽药物的质量控制技术研究多肽药物是指由两个或更多的氨基酸残基以肽键连接而成的分子，具有较高的生物活性和特异性。
多肽药物在治疗某些疾病方面具有广泛的应用前景，但药物的质量与其安全性和有效性直接相关。
因此，多肽药物的质量控制技术研究至关重要。
一、多肽药物的质量控制技术概述多肽药物的质量控制包括药物的配方、制备、分离和纯化、质量检测等方面。
当然，质量控制的重点在于质量检测。
多肽药物的质量检测是一个系统的过程，它包括药物的原材料评估、药物的中间产品检测和药物的终端产品检测。
多肽药物的原材料评估主要包括对多肽原料的合法性和纯度进行检测。
原料的合法性检测主要是为了确保原料来源合法，没有违法添加有害物质。
原料的纯度检测则是为了确保所挑选的原料纯度较高，与制备药物适应。
多肽药物的中间产品检测是为了控制各生产环节中的质量，以便及时调整生产工艺和流程，避免不良品的产生，及时发现问题，有针对性解决生产过程中存在的问题。
多肽药物的终端产品检测是为了确保最终产品的质量和安全性。
终端产品检测要求比较严格，因为它与药物最终使用的效果直接相关。
二、多肽药物的质量检测技术1. 色谱分析技术色谱分析技术是多肽药物质量检测的重要手段。
目前，主要应用的是高效液相色谱(HPLC)和气相色谱(GC)。
HPLC技术是一种高效、准确、灵敏的方法，是分离、提纯、检测多肽药物的主要方法之一。
HPLC分离率高，检测精度高，准确性高，可检测非常小的样品，有很高的分辨能力和特异性。
GC技术则主要用于多肽休克素的质量控制。
由于多肽休克素粘度低，难以在HPLC中有效分离，在GC中得到更好的明暗效果。
2. 质谱技术质谱技术是多肽药物质量检测的关键技术之一，它具有高准确性、高灵敏度、成分分析能力强、无需标记等特点。
质谱分析的主要方法包括质谱测定、质谱碎片分析、电喷雾（ESI）和基质辅助激光解析（MALDI）等技术。
质谱技术是多肽药物质量检测的常用手段，也是研究药物药理活性、药物代谢及动力学方面的重要手段。
多肽类物质分析检测方法的研究进展
摘要在蛋白质组学研究中，多肽类物质的分析测定是非常重要和活跃的研究领域，从中可以发现和利用其重要的生物活性组分，是目前新药物研发的关键。
近年来，随着新仪器和检测技术的开发，国内外在研究多肽的分析检测方法上取得了较大进展。
就目前国内外多肽类物质分析测定的最新方法和进展情况加以概述。
关键词多肽分析高效液相色谱毛细管电泳质谱中图分类号TQ 464.7第一作者简介：杜晓宁女1955年生教授级高工从事同位素化学与仪器分析多肽是一种由56个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的聚合物，当氨基酸残基在20个以下时称为寡肽，超过20个氨基酸残基则称为多肽，当聚合的氨基酸多于50个时，常称为蛋白质。
通常在不严格区分的情况下，寡肽和多肽都称为多肽。
多肽广泛存在于自然界中，并对人体有着重要的生理作用。
近年来，随着生命科学研究的蓬勃发展，有关多肽的研究进展也日新月异。
多肽已在免疫功能、信息传导、细胞分泌、前体信号、疾病发生及治疗等方面显示出了神奇的研究应用价值。
在对多肽的结构与功能研究过程中，必然会涉及多肽的测定。
目前，多肽的测定主要包括结构的测定（即测定多肽的氨基酸组成、含量）及多肽测序（即组成多肽的氨基酸的连接次序）。
本文就目前国内外多肽类物质分析测定的最新方法和进展情况加以概述。
1多肽测定的传统方法传统的多肽结构测定方法是采用柱前或柱后衍生的氨基酸分析方法测定多肽水解后得到的各种氨基酸及其含量，以确定其组成；同时，还可根据氨基酸的数目计算多肽含量。
经典的多肽测序方法有N-末端序列测定的化学方法（Edman 降解法）和C-末端酶解方法两种[1]，分别是利用不同的物质与多肽的N-端氨基或C-端羧基反应生成相应的氨基酸。
并将这一反应重复循环，测定多肽中的氨基酸排列顺序。
2多肽测定方法的新进展随着科学技术发展的日新月异，各种新的测试技术和检测仪器不断涌现，对于多肽，无论是在其结构测定还是测序方面均取得了巨大的进展。
目前，高效液相色谱（HPLC ）、毛细管电泳（CE ）、质谱（MS ）及其联用技术已成为多肽测定的主要手段，并正得到越来越广泛的应用。
高效液相色谱在多肽分离分析中的应用
高效液相色谱在多肽分离分析中的应用李文龙;张慧;汤琦;高利龙;丛海林;于冰【摘要】多肽的高生物活性和低毒副作用使其成为近来国内外生命科学研究的热点,因此多肽的分离与分析也愈发的关键.高效液相色谱(HPLC)以其极高的分离效率和良好的选择性已经成为实验室和工业分离分析生物大分子最常用和有效的方法.本文主要介绍了HPLC以及一些新型色谱在多肽分析分离中的应用.%Polypeptide has become the focus of life science research at home and abroad because of its high bioactivity and low toxicity. High performance liquid chromatography(HPLC)with high separation efficiency and good selectivity has become the commonly used and the most effective method in laboratory and industrial separation and analysis of biological macromolecules. T his review mainly summarized the ap-plication of HPLC and some new chromatography techniques in the separation and analysis of polypep-tides.【期刊名称】《分析仪器》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】5页(P63-67)【关键词】高效液相色谱;多肽;分离;分析【作者】李文龙;张慧;汤琦;高利龙;丛海林;于冰【作者单位】青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;纤维新材料与现代纺织国家重点实验室培育基地,青岛大学材料科学与工程学院,青岛266071;青岛大学生物医用材料与工程研究院,青岛大学化学化工学院,青岛266071;纤维新材料与现代纺织国家重点实验室培育基地,青岛大学材料科学与工程学院,青岛266071【正文语种】中文随着生物化学技术的不断发展，多肽因其独特而又高效的吸收机制和非常强的生物活性，而成为生化专家们所关注和研究的热门材料。
多肽分析：揭示多肽的结构、功能与相互作用
多肽分析：揭示多肽的结构、功能与相互作用在我们的身体中，有着无数的生物分子共同建筑着我们生命的美妙。
其中，多肽，这种由数个至数百个氨基酸连接而成的物质，就是这个复杂生命体系中最基本，也是最重要的组成部分之一。
它们可以组成各种重要的生物大分子，如酶、抗体、受体和激素，并且控制生命中各种关键的生理过程。
从基础科研实验室到医药工业实践，多肽分析都是关注的重点，让我们一起了解这个令人兴奋的领域。
一、多肽的结构。
多肽是由许多氨基酸通过肽键连接起来的分子链。
这些氨基酸的次序即所谓的多肽序列，决定了多肽的化学性质和空间构象。
多肽可以进一步折叠，形成二级、三级、甚至四级结构，这些级别的结构以及其相互间的相互作用都决定了多肽的功能。
图1。
用于分析多肽结构的技术主要有X光晶体学、核磁共振以及冷冻电镜等。
这些方法能够在分子级别观察多肽的结构，为我们理解其结构提供了巨大的可能性。
二、多肽的功能。
多肽的功能多种多样，与其结构紧密相关。
如酶是一种具有催化功能的多肽，可催化生物体内的各种反应；抗体是一种识别并破坏病原体的多肽，具有保护机体免受病原体侵害的功能；激素是一种信号传递的多肽，能够调控生物体的许多生理过程。
我们可以通过多种实验方式来研究多肽的功能，如使用分子生物学的方法来研究酶的活性，使用免疫学的方法来研究抗体的识别能力，以及使用细胞生物学的方法来研究激素的作用。
三、多肽的相互作用。
多肽间的相互作用对生命活动的正常进行具有关键性的影响。
比如蛋白质之间的互作，是细胞内许多过程的基础，如信号转导、基因表达、能量代谢等。
针对多肽相互作用的研究，将使我们在理解生物体内复杂的生命过程，以及寻找疾病治疗新方法上取得更大的进展。
例如，相互作用网络可作为寻找药物靶点的新策略，对抗生素研发等具有广泛应用。
总的来说，多肽的结构、功能以及相互作用的分析研究，是揭示生命活动的基本过程以及开发新药的基础。
随着科研技术的不断进步，我们对于多肽的理解将会越来越深入，相信在不远的将来，我们会利用多肽，创造出更多治疗疾病，促进健康的新方法。
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・专题讲座・多肽物质分离与分析方法研究进展赵 锐 顾谦群 管华诗(青岛海洋大学海洋药物与食品研究所,青岛 266003)摘 要 综述了近几年来多肽类物质的提取分离与分析方法,主要包括高效液相色谱法、电泳、质谱及核磁共振等方法在肽类物质研究中的最新应用进展。
关键词 多肽,分离,分析,进展 多肽类化合物广泛存在于自然界中,其中对具有一定生物学活性的多肽的研究,一直是药物开发的一个主要方向。
生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的,生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。
随着现代科技的飞速发展,从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。
一些新方法、新思路的应用,不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。
本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。
1 分离方法采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。
对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括:盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等[1]。
这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化,同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段,如层析、电泳等。
111 高效液相色谱(H PL C)H PL C的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段,因为蛋白质、多肽的H PL C 应用与其他化合物相比,在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的,更重要的是H PL C能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。
因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上,不少学者做了大量的工作。
如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。
11111 反相高效液相色谱(R P2H PL C)结果与保留值之间的关系:利用R P2 H PL C分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。
为了获得一系列的保留系数,W ilce等[2]利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析,得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系,其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中,可减少在柱上的保留时间;在10～60氨基酸组成的肽中,非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间。
而含5～25个氨基酸的小肽中,非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。
同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响,并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件[3]。
肽图分析(Pep tide M app ing):肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点,使用专一性较强的蛋白水解酶[一般为肽链内切酶(endopep tidase)]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断,通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱。
肽图分析对多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。
利用胰蛋白酶能特意性作用于A rg 和L ys羧基端的肽链的性质,通过R P2H PL C 法采用C18柱检测了重组人生长激素(rhGH)的肽片断,成功获得了人生长激素特征性胰肽图谱[4]。
同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得,并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素[5]。
人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图,便于鉴定分析。
此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。
11112 疏水作用色谱(H ydrophobic in teracti on ch rom atography,H I C)H I C是利用多肽中含有疏水基团,可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的,其比R P2H PL C具有较少使多肽变性的特点。
利用H I C分离生产激素(GH)产品的结构与活性比R P2H PL C分离的要稳定,活性较稳定。
Geng等[6]利用H I C柱的低变性特点,将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素2Χ,通过H I C柱纯化、折叠出高生物活性的产品。
不同人尿表皮生长因子(EGF)也利用H I C纯化到了,均具有良好的生物活性。
H I C可将未经离子交换柱的样品纯化。
而R P2H PL C则不能达到这一要求。
11113 分子排阻色谱(Size2Exclusi on ch rom atography,SEC)SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质,特别对一些较大的聚集态的分子更为方便。
如人重组生长激素(hGH)的分离,不同结构、构型的GH在SEC 柱上的分离行为完全不同,从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体。
利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法,此PEG具有半衰期长、作用强的特点[7]。
一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。
11114 离子交换色谱(Iron2Exchange ch rom atography,IEXC)IEXC可在中性条件下,利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。
其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类,还有一些新型树脂,如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。
在多肽类物质的分离分析研究中,对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多,不同的多肽分离条件有所不同,特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。
W u 等[8]报道利用离子交换柱层析法,探讨分离牛碳酸酐酶异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件,获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。
11115 膜蛋白色谱(Ch rom atography of M e m brane P ro tein,C M P)C M P+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统,一般有去垢剂(如SD S)溶解膜蛋白后形成SD S2融膜蛋白,并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。
羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团(P2端),又具有阳离子钙(C2端),与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SD S结合量有关。
利用原子散射法研究c AM P的分离机制发现,样品与SD S结合后在离子交换柱上存在SD S分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换,从而达到分级分离的目的[9]。
11116 高效置换色谱(H igh-Perfo r m ance D is p lace m en t Ch rom atography,H PDC)H PDC是利用小分子的高效置换剂来交换色谱柱上的样品,从而达到分离目的。
它具有分离组分含量较少成分的特性。
利用H PDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素(rH G)[10]。
在研究非毒性交换剂时Jayara m a[11]发现硫酸化葡聚糖(D etran Sulfate,D S)是对Β2乳球蛋白A和B 的良好置换剂,一般D S的相对分子质量为1×104和4×104最宜。
研究表明置换剂的相对分子质量越低,越易于与固定相结合,因此在分离相对分子质量小的多肽时,需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。
11117 灌注层析(Perfusi on Ch rom atography,PC)PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法,固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。
试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性[12]。
目前市场上可供应的PC固定相种类较多,适合于不同分子量的多肽分离使用。
112 亲和层析(A ffin ity Ch rom atography, A C)A C是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲合性而分离物质的层析方法。
自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来,在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合,如抗原2抗体、酶2催化底物、凝集素2多糖、寡核苷酸与其互补链等等。
对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和,这些配基有天然的,也有根据其结构人工合成的。
Patel等[13]人利用一系列亲合柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。
固定金属亲和层析(I m mobilized M etal A ffin ity Ch rom atography,I M A C)是近年来发展起来的一种亲和方法。
其固定相基质上鳌合了一些金属离子,如Cu2+、N i2+、Fe3+等,此柱可通过配为键鳌合侧链含有L ys、M et、A s p、A rg、T yr、Glu和H is的多肽,特别是肽序列中含有H is-X-X-X-H is的结构最易结合到金属离子亲和柱上,纯化效果较好[14]。
其中胰岛素样生长因子(In sulin-L ike Grow th Facto r,IGF)、二氢叶酸还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。
Chaiken等[15]人报道了另一种亲和层析方法,利用反义多肽作为配基,这种多肽是由反义DNA表达产生,其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性,如A rg加压素受体复合物,已用此法分离得到。
DNA 与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。
将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上,将样品蛋白或多肽从柱中流过,与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。
113 毛细管电泳(Cap illary electropho resis, CE)——分离分析方法CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由H jerten发明的,其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽,使电泳效率提高了几十倍。
此技术从80年代以来发展迅速,是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。
CE根据应用原理不同可分为以下几种;毛细管区带电泳(Cap illary Zone electropho resis,CZE)、毛细管等电聚焦电泳(Cap illary Is oeletric Focusing,C IEF)、毛细管凝胶电泳(Cap illary Gel E lectropho resis,CGE)和胶束电动毛细管层析(M icellar E lectrok inetic E lectropho resisCh rom atography,M ECC)等。
11311 毛细管区带电泳(Cap illary Zone electropho resis,CZE)CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电荷不同,且分离效果只由带电性决定,比传统凝胶电泳更准确。
目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛吸管硅胶柱上的硅醇发生反应,影响峰形与电泳时间,针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进,如调节电泳液的pH值,使与硅醇反应的极性基团减少;改进毛细管柱材料的组成,针对多肽性质的不同采取不同的CZE柱来分离。