三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白的原理
氮溶指数（TCA-NSI）检测方法
氮溶指数（TCA-NSI）检测方法氮溶指数（TCA-NSI）检测方法在下面，检测的基本原理是：第一步，先用三氯乙酸和离心的方法沉淀出不可溶蛋白，然后再用凯氏定氮法测定溶液中可溶蛋白（即可溶性小肽）占总样品的百分含量C1。
第二步，用凯氏定氮测定样品中的总蛋白C2。
第三步，用可溶性蛋白的百分含量C1/总蛋白的百分含量C2 ，得到氮溶指数（TCA-NSI）附录：氮溶指数（TCA-NSI）检测方法发酵大豆蛋白中小肽的测定1、原理：利用三氯醋酸作蛋白质沉淀剂，将发酵大豆蛋白中的蛋白质和肽链较长的肽沉淀，并将其中的短链小肽用酸溶解出来，经过滤、离心、消化、蒸馏，测定其蛋白质含量，并以其占样品粗蛋白质的百分数来表示含量。
本方法是参照中华人民共和国轻工行业标准大豆肽粉标准(QB/ T 2653 -2004)基础上修订而来。
2、试剂及仪器：1）100ml烧杯；2）10ml，50ml移液管；3）干过滤装置；4）半微量法或全量法粗蛋白质测定的试剂和装置；5）15％三氯醋酸溶液；6）4000 转/ 分钟的离心机。
3、方法：准确称取样品6克于100 ml烧杯中,准确加入15 %三氯乙酸溶液50 毫升，混合均匀，静置5 分钟，以中速定性滤纸干过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管，在4000 转/ 分钟下离心10 分钟，准确移取其上清液10ml于消化管中，按半微量法（消化后定容至100ml，准确移取其中10ml进行蒸馏）或全量法粗蛋白质测定方法测定其粗蛋白质含量。
同时做空白试验、测定样品的粗蛋白质的含量。
4、结果与计算：小肽%（半微量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×10×5÷m×100%÷cp×100%小肽%（全量法）=（V1－V0）×C×6.25×0.014×5÷m×100%÷cp×100%式中：V1--馏出液消耗盐酸标准液的体积，ml；V0--空白试验消耗盐酸标准液的体积，ml；C--盐酸的摩尔浓度，mol/l；6．25×0．014--蛋白质转换系数；m--称取样品质量，ｇ；cp—样品的粗蛋白质含量，%。
(整理)小肽检测方法
肽含量检测方法—三氯乙酸沉淀法（TCA-NSI）（可溶解小分子含氮物质定量测定）一．二．关于富力肽中小肽含量的确定：1．1 检测方法：三氯乙酸氮溶指数（TCA—NSI）1．2 原理：三氯乙酸是一种蛋白质沉淀剂，它可以沉定蛋白质和较长的肽段。
随着酶解反应的进行，蛋白质的肽链逐渐被切成大小不等的片段，三氯乙酸氮溶指数提高。
因此，三氯乙酸氮溶指数可以准确地反应蛋白质的酶解情况，溶解指数越高，表明小肽的含量越高。
1．3 方法：见标准。
1．4 富力肽中小肽含量的确定：采用上述方法进行检测，可以确定富力肽中的小肽含量。
在富力肽的全部蛋白类物质中小肽的含量为≥65%。
在富力肽的水溶性蛋白类物质中小肽的含量为≥98%。
三．关于富力肽中小肽分子量谱的确定：2．1 检测方法：基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI—TOF—Mass Spectroscopy）2．2 原理：质谱是肽和蛋白质分析的重要工具，这主要归功于一些软电离技术的应用，其中最具代表性的即基质辅助激光解吸附电离（MALDI）。
该项技术由于方便、灵敏度高，已成为蛋白质酶解产物中肽段质量谱分析（Peptide Mass Fingerprinting）的最有效的工具。
MALDI—TOF—MS采用有紫外吸收的小分子晶体为基质，将待测物与基质结合。
然后用一定波长的激光照射，聚集的能量加热晶体，使基质晶体升华而将非挥发性的待测物释放到气相中。
MALDI主要生成待测物的单电荷离子，送入TOF（Time of Flight）分析仪，测得离子从起始谱到探测端的飞行时间，根据飞行时间的长短确定分子量的大小，从而得到一张完整的蛋白质酶解产物的肽段分子量图谱。
2．3 富力肽中小肽分子量的确定：MALDI—TOF—MS的检测结果表明，在富力肽的水溶性蛋白类物质中，富含2~6个氨基酸的小肽。
肽段的分子量区间为：分子量（Dalton）摩尔百分含量0~160 3%161~650 87% 651~1000 8% > 1000 2%。
多糖除蛋白的方法
多糖除蛋白的方法
以下就是小编给大家盘点的多糖除蛋白的方法，仅供大家参考。
多糖中常含有蛋白质，为了除去多糖中的蛋白质，常采用以下方法：
1.Sevage法：在多糖溶液中加入体积4∶1的氯仿-
正丁醇混合溶液，充分振摇，将游离蛋白质变性成为不溶性物质而沉淀，经离心或分液去除蛋白质。
2.鞣酸法（TA法）：多糖在偏酸性环境下与鞣酸结
合形成不溶于水的沉淀，从而与蛋白质分离。
该方法较为温和，但效率较低。
3.三氯醋酸法（TCA法）：多糖在三氯醋酸中形成沉
淀，从而与蛋白质分离。
该方法也比较温和，但效率同样较低。
此外，还有其他方法可以用于多糖除蛋白，如透析法、离子交换层析等。
在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的方法。
三氯乙酸沉淀蛋白的原理
三氯乙酸沉淀蛋白的原理TCA沉淀蛋白的原理主要包括以下几个方面：1.酸性沉淀：TCA是一种强酸，可生成强酸性环境。
当TCA加入样品中时，会降低样品的pH值，使其酸性增强。
在强酸性条件下，蛋白质分子上的氨基酸产生负电荷，从而导致蛋白质分子间的静电斥力减弱，蛋白质变得不稳定，易于沉淀。
此外，酸性环境还能够破坏蛋白质分子的氢键、疏水键等非共价键，使其失去原有的空间构象和功能。
2.沉淀蛋白：TCA分子中的三氯甲基基团与蛋白质中的氨基酸产生反应，形成三氯乙酸根离子与蛋白质产生结合，从而使蛋白质发生沉淀。
在酸性条件下，蛋白质的溶解度降低，形成团聚体或出现小颗粒状悬浊物。
通过离心操作，可以将蛋白质沉淀下来。
3.降解非蛋白质杂质：TCA除了沉淀蛋白质，还可以沉淀一些非蛋白质杂质，如核酸和多糖等。
由于核酸和多糖也具有负电荷，其在酸性条件下也容易发生沉淀。
因此，在TCA沉淀蛋白过程中，一些非蛋白质杂质也可以同时被沉淀下来，从而进一步净化蛋白质。
4.蛋白质沉淀的后续步骤：TCA沉淀蛋白后，需要进行一系列的处理步骤来清洗和纯化蛋白质。
常见的处理方法包括冷酒精洗涤、去除杂质的洗涤和再溶解等。
通过这些处理步骤，可以有效清除TCA和其他杂质，最终获得纯净的蛋白质。
总结起来，TCA沉淀蛋白的原理是通过酸性环境和TCA与蛋白质分子中的氨基酸反应，使蛋白质发生沉淀。
在沉淀过程中，TCA还可以同时沉淀一些非蛋白质杂质，从而起到净化蛋白质的作用。
这种方法简便易行，操作方便，广泛应用于蛋白质的提取、纯化和分析等领域。
三氯乙酸 溶解度
三氯乙酸溶解度三氯乙酸（Trichloroacetic acid，简称TCA）是一种重要的有机化合物，其溶解度受多种因素影响。
以下是关于三氯乙酸溶解度的相关参考内容。
1. 三氯乙酸的溶解性质三氯乙酸是一种极性有机酸，具有很强的溶解度。
在水中，三氯乙酸可以完全溶解，并形成氢键和电离。
其在有机溶剂如乙醇、丙酮、二甲基亚砜等中也具有较高的溶解度。
2. 影响三氯乙酸溶解度的因素（1）温度：一般来说，溶解度随温度的升高而增加。
但对于三氯乙酸，由于其分子之间的电子云互斥效应，其在水中的溶解度随温度的升高而降低。
（2）溶剂性质：三氯乙酸是一种有机酸，在非极性溶剂中溶解度较低，在极性溶剂中溶解度较高。
（3）固体形式：三氯乙酸可存在于不同的固态形式，例如晶体、颗粒或粉末状，其颗粒度和表面形态对溶解度有影响。
（4）溶液浓度：当三氯乙酸浓度较高时，其溶解度通常会降低。
3. 三氯乙酸溶解度的测定方法（1）摄氏管法：摄氏管法是一种简单的方法，通过将精确称量的三氯乙酸样品加入装有溶剂（如水）的摄氏管中，定量摇动，观察三氯乙酸是否完全溶解，以测定其溶解度。
（2）饱和溶液法：饱和溶液法是一种常用的溶解度测定方法。
通常从饱和溶液中取样，然后通过适当的方法分析样品中溶质的浓度，进而计算出溶解度。
4. 三氯乙酸溶解度的应用三氯乙酸溶液被广泛应用于实验室等领域。
例如：（1）细胞沉淀：由于三氯乙酸具有很强的沉淀作用，可以被用于沉淀和分离细胞或细胞器。
（2）蛋白质沉淀：三氯乙酸可以用于沉淀和分离蛋白质，以便进一步分析和研究。
（3）DNA提取：三氯乙酸可以用于DNA的提取和纯化过程中，以去除杂质和其他有机物。
（4）药物制剂：三氯乙酸可以用于制备药物和化妆品中的酸性成分。
综上所述，三氯乙酸是一种具有很强溶解性的有机酸。
其溶解度受到温度、溶剂性质、固体形式和溶液浓度等多种因素的影响。
测定三氯乙酸溶解度的常用方法包括摄氏管法和饱和溶液法。
三氯乙酸溶液在实验室和一些应用中广泛应用，如细胞沉淀、蛋白质沉淀、DNA提取和药物制剂等。
小肽含量测定方法
2.2.2 小肽含量的测定
（1）原理
三氯乙酸（TCA）可以去除酸不溶性的蛋白和长链肽沉淀。
余下的蛋白为低分子量的小肽类物质和氨基酸。
（2）测定方法
将待测样品0.5g，加入10mL 的10%三氯乙酸（TCA），160 r/min振荡30 min，而后4000 r/min离心15 min，取上清液做适当稀释后用Folin-酚法测定蛋白质总量。
2.2.3 Folin-酚法（lorry法）测定蛋白质总量
（1）原理
蛋白质与碱性铜溶液中的Cu2+络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与福林试剂反应，产生蓝色。
在一定浓度范围内，其颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比。
（2）试剂
甲液：A、B液的混合物，A液50份，B液1份。
A液为10g Na2CO3，2g NaOH 和0.25 g酒石酸钾钠，定容到500 mL；B液为0.5 g CuSO4定容到100 mL。
乙液：Folin-酚试剂。
（3）测定方法
标准曲线的制作：在分析天平上精确称取0.0250 g结晶牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解后转入100 mL容量瓶中，配成250 μg/mL的牛血清白蛋白溶液。
按一定的比例配成蛋白质含量为0 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL，总体积为1 mL的溶液。
各加入5 mL甲试剂，混合后室温下放置10 min，再各加入0.5 mL乙液，立即混匀。
30 min后，以不含蛋白质的溶液做对照，在650 nm处测定各溶液的吸光度，做出标准曲线。
样品的测定：同标准曲线。
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析
蛋白质沉淀浓缩方法原理及详细解析令狐采学在生化制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。
在生化制备中常用的有以下几种沉淀方法和沉淀剂：1．盐析法多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
2．有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。
3．等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。
但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。
4．非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。
5．生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。
6．热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。
第一节盐析法一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。
在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。
盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫Kb分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。
一．影响盐析的若干因素1．蛋白质浓度高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。
用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。
一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。
2．离子强度和类型一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。
在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。
每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。
离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序：磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁。
TCA 蛋白沉淀方法
100％（ｗ／ｖ）三氯乙酸得配制方法：500g三氯乙酸用227ml水来溶解,所得溶液即１00％三氯乙酸溶液.避光,4度保存.(pｒeｐａｒaｔiｏn of 100%TCA: 454ml H2O/kg TCA、Ｍaｉntain ｉn ｄarkｂoｔtｌeaｔ4ｏＣ、Ｂeｃａrｅfｕｌ，use gloｖes！！！)、培养基上清直接电泳跑出来得条带经常很难瞧，可以ＴCA沉淀浓缩后跑电泳，一般表达量大于1ｍg/ml可以瞧到明显条带，这就是我用得TCA沉淀方法，效果很好：1、菌液1０0０0g，离心５分钟，收集表达上清。
2、取500－１000ul上清于EP管中，加入1/9体积得10０％TCＡ，颠倒10次混匀。
3、样品置于冰浴中大于0、5小时，过夜效果更好.４、15000g，离心10－2０分钟,可见有棕黑色沉淀,倒掉上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口得液体。
5、将EP管倒置于吸水纸长,37度烘箱１０—20分钟，待管底无明显液体残留，如果管壁还残留有液体，可以吸水纸吸掉。
可以改成室温或用电吹风，关键就是除去管底与管壁残余液体.6、15000ｇ，离心10－20分钟,用20ｕl枪头尽量吸去管底残余得液体,此步骤要快，不然沉淀容易散开，降低蛋白回收率，一般最多几ul或者没有，注意不要吸到沉淀.7、ＥP管倒置于吸水纸长,37度烘箱5分钟，确认管壁与管底没有液体残留。
8、加入2０－５0ul Lｏadｉｎg ｂｕｆｆer，9５度加热１0nｉm，一般沉淀会自动溶解,如果不溶,用手指轻弹管壁或用２0ul枪头轻轻吸打,注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余ＴCA。
如果蓝色得Loadinｇbuｆｆer 不变成黄色，说明残余TCＡ吸弃了干净，如果变黄,一般不影响电泳。
此方法连丙酮洗这一步都省了,而且不影响电泳效果。
或者第５步与第6步改为丙酮洗：5、加入200ul冰冷得丙酮，用手指轻弹EP管,洗去管底与管壁残余得TCA.6、１50００g,离心10－20分钟，倒掉上清,将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下,除去残余在管口得液体.ＴＣA—DＯCFｏｒ pｒｅｃiｐiｔation of ｖeｒy ｌoｗ proteiｎ cｏncenｔraｔioｎ1) Ｔo oｎe volｕme of pｒotｅinｓolution,add 1／10０vｏl、of ２％DOC (Na deoxychｏｌａte, ｄeｔerｇeｎt）、２）Vorｔex anｄlet sｉt fｏr 30min ａt 4ｏC、ﻫ3)Adｄ１/10 oｆTrichloｒｏaceｔi ｃacid(ＴCA）100％vortex anｄｌet siｔON at 4oC (prepaｒation oｆ100% TC Ａ：454ｍｌＨ2O/kｇTCA、Mａinｔａin ｉｎdark bottlｅaｔ4oC、Be carｅful，ｕse ｇlｏves!！!）、４）Sｐin 1５ｍiｎ4oC ｉn microｆｕｇｅat maxｉmum speed（1５０00ｇ）、Ｃarefu ｌlｙdｉschａrge ｓupernaｔant aｎd retain the pellet: drｙtｕbe by ｉｎverｓｉon ｏｎtissuｅpapｅｒ（pellet may bｅｄifficult to see）、[ＯPTION: Wasｈｐelｌeｔtwi ｃe with ｏne vｏlumｅof cold ａｃｅtone（aｃｅｔone keep aｔ–20oC）、Ｖor ｔex and repeｌｌｅt saｍplｅs 5ｍin aｔｆull sｐeed ｂeｔｗeｅｎwａｓhes］、５）Dry ｓaｍｐles uｎder vaccuｍ（ｓｐｅｅd vａｃ) orｄryａｉr、Fｏr ＰAGＥ—SDS, resuspｅｎd sａmｐlｅs in ａminimal voｌuｍｅof saｍpleｂｕffｅｒ、(Tｈe pｒesence of some TＣＡcan giｖｅa yeｌｌow ｃｏｌour ａs aｃonｓeｑｕe ｎcｅof tｈe aciｄificａtioｎof the sample buｆｆer; titｒatｅwｉth 1N NaOH ｏr 1M TrｉｓＨCｌpH8、５ｔｏｏbｔain the normal blue sａmplｅｂuｆfｅr colｏur、)Nｏrmａl TCＡﻫTo eliminateＴCA soluble iｎtｅｒferｅnces and ｐrｏteｉn coｎceｎtr ａtion1) Ｔo a sampｌe oｆpｒotein soluｔｉｏｎaｄd Ｔrichlorｏacetic aｃｉd（TCA) 100% to get13％finａl cｏncentｒation、Ｍix and keep 5min–20oCａnd tｈｅn 15min ４oC；or lｏngeｒtime at4ｏC wｉthｏuｔthe –2０oC sｔｅｐfoｒlower ｐrotｅin cｏnceｎｔration、Ｓuggestiｏn: lｅave ON iｆｔhe prｏteiｎcoｎcｅntrａtｉon iｓvｅrｙlow、ﻫ（pｒeｐaration of1０0％ＴＣA：454ml H2O／kｇＴＣA、Mainｔａin in dａｒｋbotｔlｅat 4ｏC、Ｂe carefｕl，use glｏves!!!)、2) Spin 1５min 4oC iｎmicｒofuge at mａｘiｍｕｍspeed (150０0g)、Carｅfully dｉｓcharge sｕpｅrnaｔaｎt and retａin ｔhe pellet: dry tubｅｂy inｖｅｒsion on tiｓsue papｅr （pellｅt may be difficｕlt tｏsｅe）、ﻫ3)Fｏr PAＧＥ—ＳＤS,ｒesuspenｄsampleｓiｎa minimal volumeｏf sａmple buｆfer、（Thｅpreｓence of some TCA can give aｙeｌlow cｏloｕｒasａcoｎｓｅquencｅｏf thｅacｉdificatiｏn oｆｔhe sampｌe bｕfｆｅr ; tiｔrａｔe with 1N NaOH or １M TrisＨCｌpH8、5 to obtａｉｎthe nｏrmal ｂlue samｐｌｅbuffｅｒcｏlouｒ、) ﻫAcetone PｒecipitationﻫTo eliminate acetone soｌｕble ｉntｅｒfｅrenceｓand ｐroteiｎcoｎcentratｉoｎ1) Ａｄd ｔo1vｏｌｕme ｏf ｐroteｉn ｓolｕtion 4 ｖoｌumeｓof ｃolｄａcetｏne、Mix aｎｄkeeｐaｔleast 20min –20oＣ、（Suｇgｅstion：leave OＮiｆthe pro ｔein conceｎtratioｎｉs very lｏｗ）、ﻫ2) Ｓpｉｎ15ｍiｎ４oC ｉｎmicrｏfugｅat maximuｍsｐeed （15000g)、Carｅｆulｌy ｄischarge suｐernaｔant and retaｉn tｈe pellet：ｄｒy ｔube byｉｎｖersｉoｎon ｔissuｅpａper （pellｅｔmayｂe dｉfficult to ｓee）、ﻫ3) Ｄｒy ｓａmpｌｅｓｕnｄer vａcｃｕｍ(speeｄ-vaｃ）ｏr ｄｒy ａir tｏeliｍｉnatｅａnｙaｃetｏｎe ｒesidue (smｅll ｔuｂeｓ)、Fｏr PAGＥ—SＤS, resuｓpend saｍples ｉn a ｍｉnimal vｏluｍe of samｐｌe ｂuｆfer、EthanoｌPrecｉｐitaｔiｏnＵseｆｕl methoｄto conｃenｔraｔｅproｔｅiｎｓanｄremoval of Ｇｕａｎiｄine Hydrocｈloｒide bｅfｏre ＰＡGE-SDS１)Aｄd ｔo 1 vｏlume oｆpｒoteiｎsolution 9 ｖoｌｕmes ｏf ｃold Ethanol1０0％、Mix andｋeｅp at leaｓt 10miｎ、at –２0ｏＣ、（Suggesｔiｏn: leave ＯN)、2）Sｐin 1５ｍin 4ｏC in micrｏcｅntrifｕge aｔmaximuｍｓpeeｄ(1５０0０g)、Carefully dｉscharｇe supｅｒｎataｎｔanｄｒetain the pellet: dｒy ｔuｂe by inｖersion oｎtissue paｐｅr(pelｌet ｍａｙbe diｆficult to sｅe）、３）Wash pelｌet with 90％cｏld eｔｈanol（keeｐａt–2０oC)、Ｖortex ａndrepelｌet samｐｌes ５mｉｎａt fuｌl speed、ﻫ４）Dry sａｍplｅs under vaccum (ｓpeedｖac) or drｙａir toｅliｍinａte ａny ethanoｌｒｅｓiduｅ(smell ｔｕｂes）、Ｆor PAGE－SDS, reｓuspenｄsａmples iｎ a miｎimal volｕme of sample buffer、ﻫTCＡ-DＯＣ／AcetoｎeﻫUseful mｅthoｄto concｅｎtrate ｐrｏteiｎs and ｒｅmoｖｅacetｏne aｎd TCA ｓolｕble inｔｅrfereｎces1、To oｎe vｏlume ｏｆｐｒotｅｉｎsoluｔion adｄ2％Ｎａdeoｘycｈolate （DO Ｃ) to 0、02% final（for１0０μl sａmple, aｄd 1 μｌ2% DＯＣ)、2、Mix ａnd keｅｐat ｒoｏm tｅmperａture for ａｔleast 15 min、3、100% triｃhｌｏroacetic ａcｉｄ(ＴCA) tｏget 10% fiｎａl concｅｎtratｉoｎ（pre ｐaration ｏｆ10０%TＣA:45４ml Ｈ2Ｏ/kｇTＣＡ、Mａiｎtaｉｎiｎdaｒk bottl ｅａt 4oC、Be carｅful, usｅgloves！!!）、ﻫ４、Mｉx anｄkeｅp at room teｍpｅｒature foｒat least 1hour、ﻫ5、Spiｎａt 4ｏC fｏｒ１0 min, ｒｅmoｖｅsｕpernａtａn ｔａnｄrｅtａin tｈe pｅllet、Ｄry tube by inverｓｉon on tissuｅpａpｅr、ﻫ6、Aｄd200 μl of ice cold ａcetｏne toＴCA pellet、ﻫ7、Mix aｎd keeｐoｎiｃe ｆorａt leas ｔ１5 min、8、Spin at ４oC ｆor10 mｉn in miｃrocenｔｒifuge at ｍａｘｉmｕm spｅｅd、9、Reｍove ｓｕpｅrnａｔａｎt as befoｒe(5）, dry airｐellｅt tｏelimiｎａte anyａcｅｔoｎe ｒesidue （smell tuｂeｓ）、For PＡGE—SDS，rｅsusｐenｄsaｍples ｉｎａｍinimａl volｕme of sａｍpleｂuffeｒ、ﻫ10、(Ｔｈｅpresenｃe oｆsｏｍｅＴCA can givｅａyellow coloｕr aｓ a consequence oｆthe acｉdificaｔiｏｎof ｔhe saｍple bｕffeｒ; ｔｉtｒaｔe wｉｔh 1N ＮaOH or 1M ＴrisＨCl pH８、５to ｏbt ａin tｈe ｎorｍａl blue ｓampｌe bｕffeｒcｏlouｒ、)Aciｄiｆiｅd Aceｔone／ＭethａｎｏｌﻫUｓefｕlｍetｈod to rｅｍove acetoｎe and methanolｓoluｂle inｔｅrｆerencｅs like SDS befoｒe IＥF1）Prepare aｃidiｆied acetｏｎe: １２0mｌacetone + １0μl HCl （1ｍＭfｉnaｌco ｎcｅnｔration）、2) Pｒepare precipitation reagent: Mix ｅquａｌvolumeｓof acidifｉed ａcetoｎe aｎdmｅthanoｌand keｅp ａｔ—20ｏC、３）Tｏone volume of proteｉn solution add 4vｏlｕmes of ｃolｄpreciｐitation reag ｅｎt、Miｘand kｅep ＯＮat—2０oC、4）Ｓｐin １5min 4ｏC in microfuｇe aｔｍaxiｍuｍsｐｅｅd （１5000g）、Cａrefull ｙdischaｒge ｓupeｒｎatant and reｔain thｅｐeｌlet：dry tuｂe by inversioｎon tis ｓｕe paper (ｐellｅt mａｙｂe ｄifｆicultｔo seｅ）、ﻫ５)Ｄry sampｌｅｓｕnder vaｃcuｍ(ｓｐeed-vac）orｄry air tｏelｉmiｎａte aｎy ａcｅtｏne ｏr mｅthａnｏl resｉｄue （smell tｕbes）、TCA—Ｅtｈanol PｒｅcipitationUｓeｆul methｏｄto coｎcentraｔe prｏｔeinｓand rｅmovaｌof Guａｎidiｎe Hydｒｏchｌoriｄe bｅfoｒｅＰAGＥ—ＳDＳ１）Ｄilｕte１０—25μl sａｍpleｓtｏ100μl with Ｈ2OAdd１0０μl oｆ２0％tｒicｈloｒoacｅtｉｃaｃｉd(TCA) ａnd mｉx（preparation of 100％TCA：45４mｌH2Ｏ/ｋg TCA、Maintaｉn iｎdark bｏｔtｌeat４ｏC、Ｂe caｒeful, use gｌoves!！!）、ﻫ2）Ｌeavｅｉn ice for ２０ｍiｎ、Spｉn at ４oC for 15 min in ｍｉcrocentrifuge aｔｍaxｉｍuｍspｅeｄ、ﻫ3）Caｒｅfully ｄischａrge s ｕpｅｒnatanｔand retaiｎthe pellet：dry tuｂｅby inveｒsion on tissue（pellet ｍ4）Wash ｐellｅｔwith 100μlｉce—cold etｈanol，ａy be difｆｉcｕlt toｓee)、ﻫｄry and reｓusｐend in sａmｐｌe buffer、5）Ｉn caｓeｔhere are traces of GuHＣl prｅｓent,samｐles should bｅloadedｉmmeｄｉａteｌy afｔer boilｉng ｆor ７min at 95°C ﻫ6）(Tｈe pｒeｓｅnce of some TCA ｃａn ｇiｖe a yellow ｃolour as a ｃｏnｓequｅnce ｏf the acｉdifｉｃａｔion of ｔhｅsamｐle buffer ；ｔｉtrate ｗｉtｈ１N ＮaOH oｒ1M TriｓHCl ｐH8、5 to obtain ｔｈe normal bluｅsample ｂｕffｅr ｃolour、）ﻫPAGE preｐTM Pｒｏteｉn Cleａn-up and EnricｈmｅnｔＫit — PＩＥRCEＴｈe PAGEｐreｐ？Kiｔenａbles rｅmoval oｆｍany chemicals tｈa ｔiｎterｆｅre ｗｉth ＳDＳ－PAＧEａｎａlyｓｉｓ：gｕａniｄｉne，ammｏniｕm sulfaｔe, other mon sａlｔs, acidｓanｄbases，detergenｔs，dyeｓ, ＤNＡ,RNA，aｎd liｐids、ＰIＥＲＣE：#26800- ＰＡGＥprｅｐTMＰroteiｎCｌean—up and EｎｒicｈmｅntＫit（ｐｄｆ）ＣhloｒｏｆorｍMethanol PrｅcｉｐitationﻫUseful mｅthｏｄfoｒReｍovaｌof s ａlｔand deterｇenｔs1)To saｍple of ｓtartiｎｇvolumｅ100ul2) Add 400 ul methanol3）Ｖoｒtex wellﻫ4）Ａdd 100 ｕl cｈlorｏform5) Vortexﻫ6）Add30０uｌH2O7）Vortexﻫ8）Spin 1 miｎuｔe 14,0０00ｇ9）Remｏve top aqueouｓlayｅr (protｅin is betweeｎlaｙers）10) Ａdd 4０0ul meｔhanoｌﻫ１1）Voｒtex１2）Spin 2 minｕtes14,000 g１3）Ｒeｍovｅas mucｈMeOH ａｓpｏsｓｉbｌe ｗitｈｏut dｉｓturb14)Speeｄ—Vaｃtｏｄrynessｉng pelleｔﻫ15）Ｂring uｐｉｎ2X samｐle buｆfeｒfｏrＰAGE。
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三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白的原理
TCA 与蛋白质之间主要有以下几个方面的作用:
① 在酸性条件下与蛋白质形成不溶性盐. ② 作为蛋白质变性剂使蛋白质构象发生改变, 暴露出较多的疏水性基团, 使之聚集沉淀. ③ 随着蛋白质分子量的增大, 其结构复杂性与致密性越大, TCA 可能渗入分子内部而使之较难被完全除去, 在电泳前样品加热处理时可能使蛋白质结构发生酸水解而形成碎片, 而且随时间的延长这一作用愈加明显. ④ 电泳图谱显示,BSA , HSA 单体谱带有较明显的展宽现象, 这可能是由于TCA 的结合, 使SDS 与蛋白质的结合量产生偏差, 从而造成蛋白质所带电荷的不均一性, 造成迁移率的不一致.我们认为在电泳时使用TCA 对蛋白质样品的浓缩或除盐时, 对于分子质量大的蛋白质, 要慎重选择TCA. 对小分子量蛋白质的浓缩, 采用TCA 时也有两点需要注意: 一是用TCA 沉淀后, 尽量用丙酮彻底抽提TCA; 二是样品处理后要尽快进行电泳分析, 以免发生聚集及断裂, 造成结果分析的不准确.。