基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化
年产5000吨L-苯丙氨酸发酵工厂设计
课程设计设计题目：年产5000吨L-苯丙氨酸发酵工厂设计摘要本设计主要是进行年产5000吨苯丙氨酸工厂的初步设计。
在对苯丙氨酸的结构及其在工业中重要应用作了分析后，拟在湘潭九华经济区投资L-苯丙氨酸生产工厂。
首先，对投资项目进行了认真的地分析及对厂址进行认真地选择。
同时，对L-苯丙氨酸的生产工艺作了优化，然后依据拟定的产量与工艺流程对生产车间进行了物料衡算、热量衡算、与主要生产设备的选型，其次，对三废处理等方面也作了一个初步的设计方案。
整个设计充分考虑了目前的经济状况和今后发展的需要，从节能的角度出发选择设备。
生产流程尽量提高机械化、自动化水平，同时力求技术上先进，质量上可靠，布局上合理、规范。
关键字：L-苯丙氨酸；发酵；工厂设计目录1. 引言 (3)2. 概述...................................................... 错误!未定义书签。
2.1产品需求初步预测............................. 错误!未定义书签。
2.2投资的必要性和经济意义 ............... 错误!未定义书签。
2.3地理环境............................................ 错误!未定义书签。
2.4生产工艺选择 ................................... 错误!未定义书签。
2.5产品方案............................................. 错误!未定义书签。
2.6工艺流程图 ....................................... 错误!未定义书签。
2.7工艺要点............................................ 错误!未定义书签。
3. 物料恒算.............................................. 错误!未定义书签。
L_苯丙氨酸生产与应用
L-苯丙氨酸工业生产中采用连续发酵。
因而发酵培养基中各物质的含量对提取过程非常有利。
在对发酵液进行处理后，苯丙氨酸的提取率上升12％。
由苯丙酮酸生产L-苯丙氨酸的生产工艺，生产成本为13万元／t左右。
用此法建设500t／a的L-苯丙氨酸装置，需投资3，500万元，主产品L-苯丙氨酸并副产丙酮酸，年销售总收入可达1．3亿元，适用于中、小化肥厂利用合成氨再生气开发生产，在原料、技术和经济上占有较大的优势。
1理化性质L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine，简称L-Phe)又名L-苯基-α-氨基丙酸，为白色斜方晶系结晶粉末。
具有苦杏仁味，熔点：283℃(分解)。
自然界广泛存在于卵、乳和动物蛋白中，含量5％～6％，植物性蛋白质中约含1％。
L-苯丙氨酸可溶于水，在水中的溶解度为3％，难溶于乙醇、乙醚，在100ml水中的溶解度为51℃：4．4g。
100℃：10g。
旋光度一34．5(25℃)。
苯丙氨酸有外消旋DL-型，L型和D型。
其中最重要的是L-苯丙氨酸。
2工艺开发L-苯丙氨酸是人体的必需氨基酸，人体本身无法合成，只能由植物和微生物合成。
L-苯丙氨酸合成的起始物为五碳糖磷酸途径的中间产物赤藓糖-4-磷酸(erythrose-4-phosphate，FAP)和糖酵解过程的中间产物磷酸烯醇式丙酮酸（phophoenolpyruvate，PEP)二者缩合形成一个七碳酮糖开链磷酸化合物称为3-脱氧-α-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(3-Deoxy-O-arobinoheptu-losonate-7-phosphate，DAHP)，然后DAHP转化为莽草酸(SHIK)，然后再转化为分支酸(CHA)，由分支酸合成苯丙酮酸(PPY)，最后苯丙酮酸经转氨作用生成L-苯丙氨酸。
L-苯丙氨酸的制备方法有发酵法、酶法与化学合成法。
用化学合成法经拆分可制得L-苯丙氨酸。
国内生产厂家主要采用发酵法。
2．1一步法化学合成法路线长，副产物多，且产物为光学消旋体，需进行光学拆分，成本高。
氨基酸生产线建设之L-苯丙氨酸的发酵生产线建设的工艺初步设计
L-苯丙氨酸的发酵生产线建设的工艺初步设计作者：黄启鹏菌种描述：L-苯丙氨酸产生菌为为大肠杆菌的基因工程菌，为酪氨酸缺陷型和维生素B部分缺陷型菌株，所带质粒为经改良得重组质粒，该质粒上含有L-苯丙氨酸合成过程中的关键酶结构基因，以及卡那霉素抗性基因。
由于本菌株是酪氨酸缺陷性，在培养基中必须添加酪氨酸才能保证菌体生长，因此酪氨酸是菌体生长得限制因素之一，可以通过限制酪氨酸的量来控制菌体的生长量。
同时由于菌株含有卡那霉素抗性基因的重组质粒，因而培养基中必须加有卡那霉素，以保证菌体细胞内的重组质粒不会丢失，否则菌体性能将会发生退化，及不含重组质粒的菌体不能生长，只含有该重组质粒的菌体才能生长。
生产菌种培养工程：采用5000ml三角瓶进行摇瓶种子培养，摇瓶机型号ZHWY-3222（供参考，需调研），摇瓶装量1000ml/三角瓶，共计40瓶，其中5瓶用于检验用途，培养温度37°C，摇瓶转速240rpm，培养周期10~12hr。
菌种放瓶标准：镜检菌体呈短杆状，610nm处测定OD＞1.0，pH7.5以上。
将生长良好的摇瓶种子液无菌并瓶（标准型超净工作台型号：SW-CJ-1CU），并瓶体积2×3500ml（不锈钢锥瓶Φ200×250，上口根据1000ml三角瓶的瓶口并应有相应胶塞适配，竹节与胶管配置按图）。
采用具有洁净措施的送种框送至发酵车间。
种子送抵车间种子暂存间的冰箱，不得超过20min。
种子培养工程：确认配料罐（15m3 SUS304罐，适配电机30Kw、搅拌转速150rpm、搅拌型式四斜叶开放涡轮搅拌器一层）、输料管道（DN50 SUS304）清洗干净，并确认相应种子罐设备处于清洁待接料状态。
检查物料品名、规格、数量，在清洁的配料罐内加水至搅拌叶处，开启搅拌，将培养基（一）、培养基（二）分别投入到不同的配料槽中溶解。
搅拌均匀后，核对种子罐（30m3 SUS304罐、适配电机45Kw、搅拌转速140rpm、搅拌型式新型发酵搅拌器三层）罐号，将输料软管插入待进罐人孔，开启进料端阀门。
基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化
基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化时间：2005-5-17 10:56:24 作者：不详来源：中国发酵工业网点击数：本站另注：L-苯丙氨酸已在国内江苏部分厂家有发酵工业规模化生产，但仍然推荐此文供大家研究参考，了解工艺配方和分析方法。
L-苯丙氨酸(L-phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一,人们称其为必须氨基酸。
L-phe在生物体内是转化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分。
而且,L-phe是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素B6的重要原料。
同时,L-phe也是合成一些抗癌药物的中间体[1]。
在食品工业中,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味剂,俗称蛋白糖。
基于L-phe广泛的应用前景,近年来L-phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。
目前,L-phe的生产方法有酶法、发酵法等,直接发酵法具有可利用廉价原料直接生产L-phe的优点,发酵法生产L-phe,国外报道产酸率为2.8%,L-phe在我国还未实现规模生产[2]。
本实验对构建的重组L-phe基因工程菌E.coLiHB101. 进行发酵实验,研究了其发酵工艺条件及营养物质的流加对产物L-phe积累的影响。
1实验材料与方法1.1发酵用菌株基因重组工程菌E.coLiHB101. 。
1.2培养基1.2.1种子培养基蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。
1.2.2发酵培养基Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamat e0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖20g/L;Km40mg/L。
1.2.3补料培养基CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。
1.3培养方法1.3.1摇瓶培养250mL锥形瓶内装LB培养基25mL,接种菌种斜面后,于旋转摇床上,在37℃培养12h。
基因工程菌发酵生产l—苯丙氨酸工艺优化
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２０ ０ ２年 ２月
西 北 大学 学报 （ 自然 科 学 版 ）
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氨基酸生产线建设之L-苯丙氨酸的提炼生产线建设的工艺初步设计
L-苯丙氨酸的提炼生产线建设的工艺初步设计作者：黄启鹏发酵液的预处理：接罐前准备：确认接收罐[兼酸化罐，200m3 SUS不锈钢罐，带加热盘管（保温65±5℃），搅拌系统（转速70±1rpm），在线pH计（465-50-SC-P-S7/150/9848）]已经清洗干净，关闭接收罐罐底阀门和液位计连通阀。
确定排污阀处于关闭状态，往液位计中加满水。
接收料液：打开进料阀，通知发酵车间放罐，开始接收料液。
接料到搅拌叶上端0.5m处即开启搅拌。
料液接收结束后关闭搅拌，打开液位计连通阀门，通知发酵人员前来确定体积，体积确定后在放罐交接单上签字。
放罐体积应在175±2m3。
取样：体积确定后再开启搅拌。
搅拌10分钟后打开罐顶盖，用取样勺在液面10cm 以下取出400ml料液均分于2个干净碘量瓶中，封口，通知QC人员取样检测。
放罐单位应≥40g/L。
接收洗罐水：发酵车间洗罐后，将2.0/0.5m3洗罐水也输送至酸化罐。
均匀酸化：检查浓硫酸罐（2.5m3碳钢罐浓硫酸来至酸碱库的25m3浓硫酸罐硫酸泵型号65FIU30-32）的酸量应在1m3以上。
缓慢打开浓硫酸阀门，观察在线pH计。
当料液pH调整至4.5±0.1时继续搅拌10min。
用取样勺取出200ml酸化液于碘量瓶中，封口并通知QC人员取样检测。
关闭机械搅拌，记录加入浓硫酸的体积。
加酸体积235±65L。
通过酸化罐列管加热（or：直接通蒸汽），保持酸化液温度65±5℃。
陶瓷膜（南京九思高科 200m2/台）过滤开机前准备：开启空气压缩机（ZW155A 复盛牌），空气干燥机，合上控制柜电源总闸。
打开生产罐（透析滤液罐 200m3 SUS304）罐底阀门。
打开预过滤器（根据膜厂家要求匹配）上排空阀门，排尽管道内空气。
确认手动阀HCV02A、HCV02B关闭，HCV01A、HCV01B开启2/3，HCV03A、HCV03B开启一半。
β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其产酶条件优化
β-苯丙氨酸变位酶基因工程菌的构建及其产酶条件优化β-苯丙氨酸变位酶属于MIO-依赖氨基变位酶(MIO-dependent aminomutase),可催化α-苯丙氨酸转化为β-苯丙氨酸,是目前最有效的抗癌药物—紫杉醇的重要前体物质。
随着癌症在全球范围内发病率的逐年提升,β-苯丙氨酸需求量也日益增加。
目前,在生产中大量获取β-苯丙氨酸的方法主要是化学拆分法和Mannich反应法等,这些方法步骤复杂,产物难以纯化,生产成本昂贵还会产生有毒有害的副产物。
与这些方法相比,酶催化法有着高效、快捷、安全的巨大优势。
β-苯丙氨酸变位酶作为可以高效催化生成β-苯丙氨酸的生物催化剂受到了越来越多的关注。
本研究根据β-苯丙氨酸变位酶PAM基因序列设计合成上下游引物,利用PCR技术扩增了目的基因,并将其和表达载体pET-28a连接,构成了表达质粒pET-28a-pam。
将表达质粒转入大肠杆菌表达菌株BL21中,筛选阳性菌株,并通过酶切检测在菌株内是否成功转入目的基因条带,得到一株基因重组菌。
通过对IPTG诱导剂的单因素试验确定了最佳诱导剂含量以及最佳诱导时间,并对重组菌进行诱导表达。
以SDS-PAGE手段检测了重组菌的诱导表达并对重组酶进行了纯化。
对重组酶的基本酶学性质pH、温度以及热稳定性进行了研究,确定了重组酶的最佳催化pH为9.0,最佳催化温度为50℃,并对重组酶的热稳定性进行了验证,发现其热稳定性较好。
利用单因素试验和响应面法对重组菌的产酶条件进行了优化,确定了最优发酵条件为种龄:12.8 h,初始pH:6.7,发酵时间:25.2 h。
在最优发酵条件下,重组菌产PAM最大酶活可达11.15 U/mL,较优化前提高了 128.9%。
在3 L发酵罐中对重组菌进行扩大培养。
利用单因素试验确定了最佳溶氧为30%。
分别比较了未添加任何补料的发酵方式,培养20 h时流加30 mL补料培养基的发酵方式以及培养30 h时流加40 mL补料培养基的发酵方式。
VHb在产L-苯丙氨酸工程菌中的表达及其抗贫氧效率
般 发酵 过称 中提 高溶 氧 的 方法 相 似 ， 都集 中在 通
过改 善设 备 的供 氧能力 以及 控制各 种环境 参数 等来 提 高氧 的输 送率 ， 些 方法 均 受 到设 备 和 能耗 的限 这 制［ 。随着 分子 生物 学 技术 的快 速 发展 ， 们 更 多 ５ ］ 人 的寻求从 根本上 解决 细胞 高密度发 酵过程 中的氧供 需 的 问题 ， 中的一 种 重要 手 段 就是 利 用 现代 基 因 其
关 键 词 ： 一 丙 氨 酸 ； 明 颤 菌 血 红 蛋 白 ； 氧诱 导 ； 酵 Ｌ苯 透 低 发 中 图分 类 号 ： ８ Ｑ ７ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ０ ６８ ７ （ ０ ２ ０ ０ ９ ０ １ ０ — ３ ６ ２ １ ） ２０ ０ — ４
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基因工程菌发酵生产L-苯丙氨酸工艺优化
时间：2005-5-17 10:56:24 作者：不详来源：中国发酵工业网点击数：
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L-苯丙氨酸(L-phe)是人和动物体内不能合成的8种氨基酸之一,人们称其为必须氨基酸。
L-phe在生物体内是转化成L-酪氨酸的原料,因而L-phe成为一些氨基酸输液和氨基酸饮膳所必须的成分。
而且,L-phe是合成药物麦角胺、抗生物质和维生素B6的重要原料。
同时,L-phe也是合成一些抗癌药物的中间体[1]。
在食品工业中,L-phe最主要的用途是合成二肽甜味剂,俗称蛋白糖。
基于L-phe广泛的应用前景,近年来L-phe成为氨基酸行业单品中产量增长最快的一种。
目前,L-phe的生产方法有酶法、发酵法等,直接发酵法具有可利用廉价原料直接生产L-phe的优点,发酵法生产
L-phe,国外报道产酸率为2.8%,L-phe在我国还未实现规模生产[2]。
本实验对构建的重组L-phe基因工程菌
E.coLiHB101. 进行发酵实验,研究了其发酵工艺条件及营养物质的流加对产物L-phe积累的影响。
1实验材料与方法
1.1发酵用菌株基因重组工程菌E.coLiHB101. 。
1.2培养基
1.2.1种子培养基蛋白胨1%;氯化钠1%;酵母粉0.5%;葡萄糖2%;调pH=7.5;抗菌素Km(硫酸卡那霉素)。
1.2.2发酵培养基Na2HPO4·12H2O20g/L;Na-citrate6g/L;Na-gLutamat e0.4g/L;酪氨酸0.6g/L;葡萄糖
20g/L;Km40mg/L。
1.2.3补料培养基CaCL2·2H2O0.6g/L;酪氨酸500mg/L;葡萄糖500g/L;MgSO4·7H2O1g/L;VB1500mg/L;氨水28%。
1.3培养方法1.3.1摇瓶培养250mL锥形瓶内装LB培养基25mL,接种菌种斜面后,于旋转摇床上,在37℃培养12h。
1.3.2深层培养
在2L自控发酵罐(美国进口)中装入1L发酵培养基。
灭菌后接入5%的摇瓶种子。
通气量为1000L/L·min时,于38.5℃下搅拌培养。
搅拌转速根据溶氧(DO)调节;使用28%的氨水调节pH=7.0±0.2;采用流加葡萄糖工艺补料,补料速率由测定葡萄糖来控制。
1.4测定方法
1.4.1菌体浓度
通过测定培养液或其稀释液在波长660nm处的吸光度OD660确定菌体浓度。
一个OD660单位相当于
0.267g/L(菌体干重)。
当OD660<0.3时,有良好的线性关系。
1.4.2残糖浓度
用费林试剂法测定[3]。
1.4.3发酵液中L-phe浓度分析
用荧光法进行测定[4]。
2结果与讨论
2.1生长因子对苯丙氨酸积累的影响
通过添加不同浓度的酪氨酸,实验由图1示出:随着酪氨酸添加量的增加,产酸率提高,从发酵成本和产酸率两方面分析,得出酪氨酸的最适添加量为1.0～1.2g/L,既可得高产酸率3.68%,又可使成本不致过高。
2.2工艺与代谢副产物乙酸对苯丙氨酸的影响
通过对发酵工艺条件优化,实验得出:当发酵温度控制在38～39℃,溶解氧(DO)控制在20%,在整个实验过程中葡萄糖浓度维持在1.5%,既有利于苯丙氨酸的积累,又能有效抑制乙酸的产生,苯丙氨酸的浓度可达到3.86%,结果见图2。
3结论
1)获得了L-phe发酵的优化工艺参数为:搅拌转速450r/min,发酵温度为38.5℃,DO控制在20%,发酵液pH值为7.0,糖浓度控制在1.5%,酪氨酸添加量为1.0～1.2g/L。
另外,分析了上述工艺条件对菌体细胞生长和L-phe积累的影响。
2)溶氧控制的葡萄糖流加补料和酪氨酸分批补料双重调控可以有效地控制菌体比生长速度,减少乙酸产生,提高菌体浓度和L-phe浓度。
3)经十几批发酵条件的摸索和5批稳定发酵,该菌种重组质粒稳定,重复性好,平均产酸量36.8g/L。
参考文献:
[1]林锐.l-苯丙氨酸研究现状[J].微生物通讯,1992,26(2):15-18.
[2]范代娣,李万华,张小燕,等.732H+离子树脂在l-苯丙氨酸发酵纯化中的应用[J].西北大学学报(自然科学
版),2000,30(4):135-137.
[3]张龙翔.生物化学实验方法和技术[M].北京:高等教育出版社,1981.
[4]范长胜.荧光法测定发酵液中的苯丙氨酸含量[J].氨基酸杂志,1989,30(2):31-34.。