荧光免疫标记技术
免疫荧光技术名词解释细胞生物学
一、免疫荧光技术概述免疫荧光技术是一种通过荧光显微镜观察细胞或组织中特定分子的方法。
它利用抗体与待检测分子结合后，再加上荧光标记的二抗或荧光标记的直抗，通过荧光显微镜观察标记分子的位置和数量。
免疫荧光技术在细胞生物学和免疫学研究中得到了广泛应用，为研究生物分子的定位、表达和相互作用提供了重要技术支持。
二、免疫荧光技术的原理1. 抗体结合在免疫荧光技术中，首先需要用特异性抗体与待检测的分子结合。
这些抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体，通过它们与目标分子的结合，实现对待检测分子的高度特异性识别。
2. 荧光标记待检测分子与抗体结合后，需要加入荧光标记的二抗或直抗，使得待检测分子与荧光物质结合形成复合物。
通常使用的荧光分子有FITC、TRITC、Alexa Fluor等，它们在不同激发波长下显示出不同的荧光颜色。
3. 观察和分析最后通过荧光显微镜观察标记的细胞或组织样品，根据荧光信号的强度和分布情况，可以判断待检测分子的位置和数量，从而了解其在细胞内的表达和功能。
三、免疫荧光技术的应用1. 细胞膜标记免疫荧光技术可用于标记细胞膜上的特定蛋白，例如细胞黏附蛋白、受体蛋白等，从而观察它们在细胞膜上的分布情况和动态变化，揭示细胞膜的结构和功能。
2. 细胞器定位通过标记特定的蛋白或抗体，免疫荧光技术可以用于观察细胞器的定位，如线粒体、内质网、高尔基体等，帮助研究者了解细胞器在细胞内的分布和相互作用。
3. 蛋白相互作用免疫荧光技术也被广泛应用于研究蛋白之间的相互作用关系，通过标记不同的蛋白并观察它们在细胞内的共定位情况，可以揭示蛋白间的相互作用网络和信号传导路径。
4. 细胞功能研究通过观察细胞内荧光标记物的动态变化，免疫荧光技术可以帮助研究者了解细胞的代谢活动、信号转导和细胞周期等重要的生物学过程。
四、免疫荧光技术的发展和趋势1. 自动化和高通量随着技术的发展，免疫荧光技术已经向自动化和高通量方向发展。
自动化的设备和流程使得实验操作更加标准和高效，而高通量的技术则可以同时观察大量样品，加快研究进程。
荧光免疫标记技术
荧光染料的选择与特性
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荧光染料种类
常见的荧光染料包括异荧光染料特性
不同的荧光染料具有不同的激 发波长和发射波长，可选择适 用于不同检测需求的染料。
荧光染料标记方式
荧光染料稳定性
荧光染料可以通过化学键合、 生物素-亲和素系统等方式与抗 体或抗原结合。
反应条件控制
为了确保抗原-抗体反应的顺利进行，需要控制适宜的反应条件， 如温度、pH值和离子强度等。这些条件会影响抗原和抗体的活性 以及它们之间的结合能力。
荧光染料的标记与染色
选择合适的荧光染料
根据实验需求选择具有特定波长的荧光染料，以便在检测时能够产生明显的荧 光信号。荧光染料应具有高灵敏度、低背景干扰和稳定性好的特点。
标记抗原或抗体
将荧光染料与抗原或抗体结合，形成带有荧光的标记物。标记的过程可以通过 化学方法或生物技术实现，确保荧光染料与抗原或抗体牢固结合。
结果观察与数据分析
荧光显微镜观察
通过荧光显微镜观察抗原-抗体复合物的荧光信号，可以定性或定量分析样本中 的抗原含量。观察时需注意控制激发波长和发射波长，以获得最佳的荧光信号。
数据分析
利用相关软件对荧光信号进行定量分析，通过测量荧光强度、荧光分布和荧光色 彩等信息，计算抗原浓度或细胞数量等指标。数据分析有助于提高实验结果的准 确性和可靠性。
04
荧光免疫标记技术的优缺点
优点
高灵敏度
荧光免疫标记技术能够检测到低浓度的抗原或抗 体，具有较高的灵敏度。
特异性高
荧光免疫标记技术通常采用特异性的抗体或抗原 ，能够针对特定的目标进行检测，具有较高的特 异性。
流式细胞术
利用荧光免疫标记技术对细胞 表面抗原进行标记，通过流式 细胞仪进行检测和分析，可以 对细胞进行分群、计数和功能 研究。
免疫荧光的技术介绍
免疫荧光的技术介绍免疫荧光技术是一种基于抗原-抗体反应的荧光标记技术，常用于生物医学研究领域中的细胞、组织以及溶液等样本的分析和检测。
以下是关于免疫荧光技术的详细介绍：1.技术原理免疫荧光技术利用抗原-抗体反应的特异性，将荧光标记物与抗体结合，从而实现对样本中特定抗原的精确检测。
抗原-抗体反应具有高度的特异性和灵敏性，使得免疫荧光技术成为一种具有高分辨率和高灵敏度的分析方法。
2.常用样本类型免疫荧光技术适用于多种类型的样本，包括细胞、组织、溶液等。
其中，细胞样本可以是单细胞悬液、细胞培养物或组织切片等；组织样本可以是病理切片、器官组织等；溶液样本则可以是血清、尿液、脑脊液等体液成分。
在制备样本时，需要保持样本的稳定性和活性，以便进行后续的实验操作。
3.标记方法免疫荧光技术的标记方法主要包括荧光素、生物素、抗生物素等。
其中，荧光素是最常用的标记物之一，其具有高荧光量子产率、良好的光稳定性以及优良的生物相容性等特点。
生物素和抗生物素则是一对亲和素和抗亲和素的标记物，可以用于放大免疫反应的信号，提高检测的灵敏度。
此外，标记过程中的关键控制参数包括抗体浓度、孵育时间、温度和pH值等，需要根据实验的具体情况进行优化和调整。
4.荧光显微镜观察在进行免疫荧光实验时，需要使用荧光显微镜对样本进行观察和拍照。
荧光显微镜的基本构造包括激发光源、滤光片、目镜和物镜等部分。
在观察时，需要选择适当的激发光源和滤光片，以最大程度地激发荧光信号并抑制背景噪声。
同时，需要调节物镜和目镜的焦距，以便清晰地观察到样本中的荧光信号。
拍照时，需要选择合适的曝光时间和增益，以便真实地记录样本中的荧光信号。
5.数据分析与解释对于观察到的荧光信号，可以使用相关的图像分析软件进行定性和定量分析。
这些软件通常具备多种图像处理功能，如背景噪声的去除、信号强度的测量、目标区域的识别等。
结合文献资料，可以对数据分析结果进行深入探讨，从而得出有关样本中抗原分布和含量的有价值的信息。
免疫标记技术实验报告
免疫标记技术实验报告前言在生命科学研究中，免疫标记技术是一项十分重要的实验技术。
它利用特异性抗体或结合蛋白，标记或定位待检测分子，实现对生物体内各种生物分子的检测和研究。
本实验报告以免疫荧光标记技术为例，详细介绍了该技术的实验原理、实验步骤及结果分析，旨在帮助读者深入了解免疫标记技术的实验方法和应用。
实验原理免疫荧光标记技术是利用荧光标记的抗体特异性识别和结合目标分子，从而对目标分子进行检测和定位。
本实验中，我们通过荧光标记的抗体识别和结合细胞膜表面的受体，实现对目标细胞的检测和定位。
实验中所使用的抗体标记方式是间接标记法，即将特异性初级抗体与荧光标记的二级抗体结合，从而实现对目标细胞的检测。
实验步骤1.细胞培养和处理将细胞培养于无菌培养皿中，细胞密度约为80%时，加入刺激剂并继续培养。
处理时间和刺激剂的浓度需根据不同的实验目的和要求进行调整。
2.制备抗体溶液将荧光标记的抗体或间接标记法所需要的初级抗体和二级抗体制备至适当浓度。
常用抗体浓度范围为1:100-1:500。
3.活细胞荧光标记用1倍PBS将培养皿中的细胞洗涤3次，去除细胞培养基和死细胞。
随后，向细胞中加入刚才制备好的荧光标记的抗体，并在室温下旋转轻轻混合15分钟。
4.洗涤和染色用1倍PBS将细胞混合物洗涤2次，并用1倍PBS悬浮细胞混合物。
接着，用50%甘油液将混合物微量涂于载玻片上，用甘油溶液瞬时固定细胞，形成细胞染色。
5.显微镜观察用荧光显微镜观察载玻片中的细胞荧光信号，并拍摄显微镜图像。
可以通过比对不同实验条件下的细胞标记和没有标记的对照组，对实验结果进行分析和比较。
结果分析免疫荧光标记技术的应用范围十分广泛，本实验以细胞膜表面受体为例，介绍了该技术的实验步骤和原理。
通过观察显微镜下的荧光图像，可以发现被荧光标记的细胞荧光信号比未被标记的细胞荧光信号强烈许多，从而实现了对目标细胞的检测和定位。
但是需要注意的是，免疫标记技术中所使用的荧光标记物在实验过程中会产生光漂白和光淬灭的现象，从而降低检测信号的强度和可靠性。
免疫荧光标记技术原理
免疫荧光标记技术原理
免疫荧光标记技术是一种常用的分子生物学技术，它基于抗体与特定抗原的特异性结合，并利用荧光染料标记抗体来实现对特定分子的检测和定位。
该技术具有高灵敏度、高特异性、高空间分辨率等特点，被广泛应用于细胞学、病理学、免疫学等领域。
该技术的实现分为两个步骤：首先是抗体的制备，包括抗原的筛选、抗体的克隆和纯化等；其次是荧光标记抗体的制备，包括荧光染料的选择、标记反应的条件优化等。
在使用免疫荧光标记技术进行实验时，通常需要先对样品进行特定的处理，例如细胞固定、抗原检测和荧光染色等。
然后，将标记好的荧光抗体加入样品中，让其与目标分子结合，形成荧光标记的复合物。
最后，通过荧光显微镜等设备观察标记复合物的位置、数量和形态等信息。
总的来说，免疫荧光标记技术是一种高效、准确的分子生物学技术，为研究细胞结构、功能和疾病发生机制等提供了有力的工具。
- 1 -。
荧光免疫标记技术
适用于标记样品量少、蛋白含量低的抗体溶液，此法标记抗体比较 均匀，非特异性染色也比较少。
【主要试剂与器材】 1．器材 （1）铁立架、蝴蝶夹、层析柱、洗脱瓶、搅拌器、磁棒、
紫外分光光度计 （2）烧杯、试管、滴管、吸管、洗耳球、pH试纸、黑纸 2．试剂 （1）抗体 （2）异硫氰基荧光黄（FITC） （3）葡聚糖凝胶（Sephadex G-25） （4）pH9.5，0. 5M 碳酸缓冲液 （5）pH7.0，0.005M 磷酸缓冲液
免疫标记技术的应用 标记物与抗原、抗体的连接技术； 标记后的抗原、抗体进行特异性检测的实验设计原理 以及相应的检测仪器的使用方法。
免疫荧光标记技术（immunofluorescence technique）
是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素，当与其相对应 的抗原或抗体起反应时，在形成的复合物上就带有一定量 的荧光素，在荧光显微镜下就可以看见发出荧光的抗原抗 体结合部位，检测出抗原或抗体。
荧光免疫标记技术
免疫标记（immunolabelling technic）
是指用一些易测定的、具有高度敏感性的标记物质：荧光素、放射 性核素、酶、胶体金、生物素、铁蛋白及化学（或生物）发光剂等作为 追踪物，标记特异性的抗原、抗体分子进行的抗原、抗体反应。
通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原、抗体的性 质与含量。并借助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、电子显微 镜和发光免疫测定仪等精密仪器对试验结果直接镜检观察或进行自动化 测定。
免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微 示踪的精确性相结合。
以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不 影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试 剂，用于检测和鉴定未知的抗原。
免疫--荧光免疫技术 图文版
荧光素要求
有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易 解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 标记方法简单、安全无毒。 与蛋白质的结合物稳定，易于保存。
荧光偏振
当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期（对于荧光素约持续 4纳秒）保 持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平 面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。 如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直 的和水平的偏振平面检测发射光光强（发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标 记的分子的迁移率有关）。如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高 如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。
4.5
Tb3+-PTA
14
Dy3+-PTA
3.0
荧光寿命(ns) 65000 60000 714000 925000 96000 1000
时间分辨荧光免疫测定 标记方法
双功能螯合剂 1-（对-苯偶氮）-EDTA 异硫氰酸苯基-EDTA 异硫氰酸苯甲基-DTTA 二乙烯三胺五乙酸（DTPA）
荧光（fluorescence）
荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃 迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释 放出能量，称为荧光。
发射光谱和激发光谱
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样 品发射荧光的强度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发 光激发样品记录的相应的荧光发射强度。
荧光免疫试验
免疫荧光
酶底物产物激发光发射光 Β-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA二聚体 317 414 ⑷合适荧光素的选择 1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。 荧光素-N=C +NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质 ‖ ︱ ︱‖ ︱ S H H SH 2）荧光效率高，标记后下降不明显。 3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
实验步骤
直接法测抗 原
间接法测抗 体
⑴基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。 缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查 和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。 ⑵试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架
1）荧光色素
许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有 机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：
⑴异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶 剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490--495nm，最大发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，结 构式如下：
标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生 反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。
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讨论分析
荧光 荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的 荧光寿命---荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的 荧光衰减到一定程度所用时间。 荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 荧光淬灭---荧光物质的荧光辐射能力在受到激发 光较长时间的照射后发生的减弱现象。 淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 淬灭剂---苯胺、硝基苯、酚等 荧光（标记）物质的保存
1
1
考核
配分与评分标准
序号 3 考核要点 ⑴ 以PBS冲洗抗原 PBS冲洗抗原 基质片 (2) 浸于盛有PBS染 浸于盛有PBS PBS染 色缸中 反复漂洗3 ⑶ 反复漂洗3次 每次5min ⑷ 每次5min 分 值 1 1 评分标准 不符合要求将此分扣 除 得分
1
考核
配分与评分标准
序号 4 考核要点 ⑴ 取出玻片，吹干 取出玻片， (2) 加50l最适工 50l最适工 作浓度的标记抗 体 ⑶ 平置于湿盒内， 平置于湿盒内， 37oC温箱反应 37oC温箱反应 30min 分 值 1 1 评分标准 不符合要求将此分扣 除 得分
其他荧 光免疫 技术
任务过程
复习提问 2′ 2′ 30′ 40′ 10′ 5′ 1′
教 学 环 节
案例导入 讲解与示教 学生操作 讨论分析 评价、考核 评价、 课后思考题
案例导入
患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽3天。体 间断发热五天，伴咳嗽3 患儿， 温最高39 39度 病程第2天查血常规正常， 温最高39度，病程第2天查血常规正常，诊 呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素” 断“呼吸道感染”并静滴“阿奇霉素”3天 无明显改变，即而出现咳嗽， ，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性 刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理 刺激性咳嗽，少痰，胸片提示： 增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。 增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。 患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 如何快 速诊断？ 速诊断？
讨论分析
异硫氰酸荧光素(FITC) 异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光色素: 荧光色素:能够产生明显 荧光并能作为染料使用 的有机化合物称为荧光 色素或荧光染料。 色素或荧光染料。用于 标记抗体的荧光色素， 标记抗体的荧光色素， 必须具有化学上的活性 基因， 基因，能与蛋白质稳定 结合， 结合，且不影响标记抗 体的生物活性及抗原抗 体的特异性结合。 体的特异性结合。
实验操作
【结果判断】 结果判断】
1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性； 1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性； 荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色 反之为阴性。 反之为阴性。 2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型： 2.根据荧光分布情况 可分为四种荧光核型： 根据荧光分布情况， 均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。 ⑴均质型:细胞核呈均匀一致的荧光。 ⑵周边型:细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或 周边型:细胞核周围呈现荧光， 无荧光。 无荧光。 斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。 ⑶斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。 核仁型：核仁部分呈现荧光。 ⑷核仁型：核仁部分呈现荧光。
实验操作
实验操作
【注意事项】 注意事项】
1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片 1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片 样品之间防止交叉污染。 。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒 防止干燥。 内，防止干燥。 2.每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。 2.每次冲片应彻底 防止非特异荧光的干扰。 每次冲片应彻底， 3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注 3.荧光受温度影响较大 荧光受温度影响较大， 意低温避光保存。 意低温避光保存。
讨论分析
荧光
荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后， 起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。 起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一 种可吸收激发光的光便能产生荧光， 种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用 的有机化合物，亦称荧光色素。 的有机化合物，亦称荧光色素。 发生原理---基态 发生原理---基态激发态 基态 产生特点：激发---即刻产生 产生特点：激发---即刻产生 停止激发---瞬间消失 停止激发---瞬间消失 种类---光致荧光 化学荧光， 线荧光， 种类---光致荧光，化学荧光，X线荧光，阴极射线荧光 光致荧光，
讨论分析
免疫荧光技术免疫荧光技术- 基本原理
免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显 微示踪的精确性相结合。 微示踪的精确性相结合。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但 以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、 不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准 不影响其免疫学特性。 试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗 在荧光显微镜下， 体复合物及其存在部位。 体复合物及其存在部位。
实验操作
【操作方法】 操作方法】
1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈 1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温， 自冰箱中取出抗原基质片 标记。 标记。 2.将待检血清和对照血清用PBS作1∶10稀释，用微量 2.将待检血清和对照血清用 将待检血清和对照血清用PBS作 10稀释 稀释， 加样器加50l待检血清或对照血清于基质片上 待检血清或对照血清于基质片上， 加样器加50l待检血清或对照血清于基质片上，水平置 于湿盒中37oC温箱反应30min 37oC温箱反应30min。 于湿盒中37oC温箱反应30min。 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 3.以PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有PBS染色缸 冲洗抗原基质片 反复漂洗3 每次5min。 中，反复漂洗3次，每次5min。 4.取出玻片，吹干，加50l最适工作浓度的标记抗体， 4.取出玻片 吹干， 50l最适工作浓度的标记抗体 取出玻片， 最适工作浓度的标记抗体， 平置于湿盒内，37oC温箱反应30min。 平置于湿盒内，37oC温箱反应 温箱反应30min。 5.重复步骤3，洗去未结合的荧光抗体。 5.重复步骤 重复步骤3 洗去未结合的荧光抗体。 6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。 6.滴加缓冲甘油封片 用荧光显微镜观察。 滴加缓冲甘油封片，
讨论分析
提 出 问 题
展 开 讨 论
讨论分析
免疫荧光技术 免疫荧光技术（ 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免 又称荧光抗体技术。 疫学、 疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建 立起来的一项技术。 立起来的一项技术。
该技术的主要优缺点 主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。 主要缺点： 主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决， 结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。 结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。
1
考核
配分与评分标准
序 号 5 ⑴ 考核要点 重复步骤3 重复步骤3， 洗去未结合 的荧光抗体 分 值 1 1 评分标准 不符合要求将此分 扣除 得分
荧光免疫显微技术
Laser
FALS Sensor
前向角散射光（FSC）： ）：反映细胞的大小 前向角散射光（FSC）：反映细胞的大小
讨论分析
荧光免疫显微技术
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
侧向角散射光（SSC）：反映细胞内的颗粒多少 ）：反映细胞内的颗粒多少 侧向角散射光（SSC）：
任务八 任务八 荧光免疫标记技术 荧光免疫标记技术
任务目标
1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在 1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在 医学检验中的应用 知识目标 2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器 2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器 和设备 3.了解荧光抗体的制备 3.了解荧光抗体的制备 1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备 1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备
实验操作
【应用与评价】 应用与评价】 荧光抗体技术应用较广， 荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定 及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测， 及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测， 免疫细胞表面抗原的检测等。 免疫细胞表面抗原的检测等。 此方法检测ANA，主要用于初步筛查， 此方法检测ANA，主要用于初步筛查，具有简便 快速、敏感等特点。 、快速、敏感等特点。
讨论分析
荧光免疫显微技术 基本原理---荧光显微镜；荧光Ab；标本 （组织或细胞中Ag) 技术类型： 直接法---荧光素标记Ab直接检测 重点 间接法---荧光素标记二抗 补体结合法---荧光素标记抗补体Ab 双结合法---两种荧光素标记Ab
讨论分析
讨论分析
间接免疫荧光检测自身抗核抗体
讨论分析
考核ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
配分与评分标准
序号 考核要点 (1) 抗原基质片，平衡 抗原基质片， 至室温 分值 1 1 评分标准 不符合要求将此分扣除 得分
1
(2) 记号笔画圈标记
(1)
2
待检血清和对照血 清用PBS作 10稀 清用PBS作1∶10稀
不符合要求将此分扣除 1
释 (2) 微量加样器50l待检 微量加样器50l待检 血清或对照血清于 基质片上 水平置于湿盒中37oC ⑶ 水平置于湿盒中37oC 温箱反应30min 温箱反应30min
学生操作
一位学生 操作演示
老师纠正 点评
学生分组 再操作
实验操作
【主要试剂与器材】 主要试剂与器材】 1.抗原基质片 固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切 1.抗原基质片 固定有核抗原， 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。 2.标记抗体 FITC标记的羊抗人IgG，有商品化试剂供 2.标记抗体 FITC标记的羊抗人 标记的羊抗人IgG， 临用时稀释至工作浓度。 应。临用时稀释至工作浓度。 3.0.01mol/L pH7.2PBS。 pH7.2PBS。 4.缓冲甘油 9份甘油和1份PBS混匀。 4.缓冲甘油 份甘油和1 PBS混匀 混匀。 5.待检血清，阴性、阳性对照血清。 5.待检血清 阴性、阳性对照血清。 待检血清， 6.其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。 6.其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。