免疫荧光组化技术
免疫组化与免疫荧光的区别2页
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免疫组化和免疫荧光的区别是免疫荧光属于免疫组化，是免疫组化中的一种技术方法。
免疫组化检查指应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色，确定组织或细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及相对的定量检查。
按标记物质的种类分类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤分类，可分为直接法和间接法，间接法的灵敏度提高了许多。
综上，免疫荧光法是免疫组化检查的一种技术方法。
免疫组化与免疫荧光都是经过免疫原，两者原理相似，仅是显色剂不同。
免疫组化使用酶进行显色，而免疫荧光一般不使用酶进行显色。
另外，免疫组化通常在明视野进行观看，而免疫荧光则是在暗视野观看。
患者进行治疗首先需明确诊断疾病，若无精准诊断则无精准治疗。
免疫组化与免疫荧光的真正目的均为明确病理诊断，以便患者获得精准治疗。
免疫组化是应用免疫学的基本原理，也就是抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来确定组织
细胞内的抗原，对其进行定位、定性和相对定量的研究。
进行免疫组化的时候，经常使用的显示剂包括荧光素、酶、金属离子或者是同位素。
免疫荧光就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素，标记在抗体或者抗原上，与其相应的抗原或抗体结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。
免疫荧光 免疫组化 实验技术
1甲醛（formaldehyde）是无色气体，易溶于水成为甲醛溶液。
易挥发，且有强烈刺激气味，常用得是37％～40％得甲醛溶液，商品名为福尔马林（formalin）。
用作固定的浓度习惯为10％福尔马林（即1份甲醛溶液加9份水配制而成），实际含甲醛4％。
10％福尔马林渗透力强，固定均匀，对组织收缩少。
对脂肪、神经及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定剂。
经福尔马林固定时间长的组织，易产生黑色的沉淀，称福尔马林色素。
2 乙醇无色液体，易溶于水，它除可作为固定剂外，还可作为脱水剂，对组织有硬化作用。
固定用一般是80%~95%浓度，乙醇渗透力校弱，它能溶解脂肪，核蛋白被沉淀后，仍能溶于水，因此核的着色不良。
3 中性甲醛液（混合固定液）甲醛（浓）120ml，加蒸馏水880ml,磷酸二氢钠（NaH2PO4•H2O）4g，磷酸氢二纳（Na 2HPO4）13g。
此液固定效果比单纯10％福尔马林要好。
4 AF液（混合固定液）95％乙醇90ml，甲醛(浓)10ml。
也有配方是95％乙醇85ml，甲醛（浓）10ml，冰醋酸5 ml。
此液除有固定作用外，兼有脱水作用，因此，固定后可直接入95％乙醇脱水。
以上4种固定液中，以中性甲醛为首选，其次为10％福尔马林，乙醇应尽量不用。
IF免疫细胞化学和免疫荧光实验载玻片/盖玻片处理聚醚酰亚胺或多聚赖氨酸在室温下包被盖玻片1小时。
无菌水冲洗盖玻片（3次，每次5分钟）。
可将盖玻片干完全干燥，并在紫外光下消毒至少4小时。
在玻片上种植细胞，或准备细胞离心涂片器，或做好涂抹准备。
磷酸盐缓冲液（ PBS ）进行简短的冲洗。
第一步：细胞固定用预冷的甲醇、丙酮（ 1-10分钟），或3-4 ％甲醛（PBS的pH值7.4）室温（或者-20 ℃)固定细胞片15分钟。
用预冷的PBS冲洗细胞片两次。
透化：如果目的蛋白是胞内表达，透化细胞非常重要。
注：丙酮固定标本不需要透化。
用含0.25% Triton X-100或100 μM 洋地黄皂苷 or 0.5% 皂苷的PBS室温孵育标本10分钟。
免疫荧光组织化学技术
免疫荧光组织化学技术哎呀，今天咱们聊聊一个有意思的话题，免疫荧光组织化学技术。
听起来复杂，但其实就像一场科学的派对，大家聚在一起，拼拼凑凑，把那些看似无关的元素串联起来。
想象一下，你的细胞就像是一个个小明星，在显微镜下闪闪发光，个个都有自己的故事。
这种技术可不简单，它就像一位经验丰富的侦探，能帮助我们找到细胞中的“坏蛋”，比如肿瘤细胞，真是神奇得很。
咱们得明白免疫荧光技术是咋回事。
简单来说，就是通过荧光染料把特定的蛋白质标记出来。
想象一下，你在黑暗的房间里找东西，突然一束光照过来，嘿，原来那个藏得严严实实的玩意儿就在那儿，闪闪发亮。
这就是荧光的魅力所在，科学家们利用它，把细胞里的蛋白质打扮得漂漂亮亮，让它们在显微镜下活灵活现。
试想，原本平淡无奇的细胞，瞬间变成了一场视觉盛宴，简直让人眼前一亮。
可能有朋友要问，为什么要用荧光呢？这可得从细胞的秘密说起。
细胞里的蛋白质可是个复杂的大家伙，各种各样的都有，像是五花八门的食材，怎么能轻易看出谁是谁呢？免疫荧光就像给它们穿上了个性化的衣服，让每种蛋白质都有了自己的标签。
这样一来，科学家就可以通过不同的颜色，轻松区分出不同的蛋白质。
想象一下，像彩虹一样的细胞，看到这场景，简直让人乐开花。
免疫荧光的应用可真是广泛，医学研究、疾病诊断、甚至药物开发，都离不开它的帮忙。
比如，研究者们在寻找癌细胞的时候，往往需要精准定位。
这里，免疫荧光就像是个定位器，能够精确找到目标，省时省力。
就好比你在一片沙滩上寻找贝壳，有了指南针，方向感一下子强多了，找起来也是得心应手。
不过，免疫荧光技术也不是说简单就能上手的。
它需要一些特定的步骤，像是细胞准备、抗体选择、荧光染料的使用等等。
这就像做一道复杂的菜肴，光有好食材还不够，得掌握火候和调味，才能做出美味可口的佳肴。
科学家们可得小心翼翼，每一步都不能马虎。
要不然，最后的结果就可能让人大失所望，原本该闪闪发光的细胞，可能会变得黯淡无光，真是让人捏把汗。
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光
摘要：
I.免疫组化
A.定义
B.应用
C.优点
D.缺点
II.免疫荧光
A.定义
B.应用
C.优点
D.缺点
III.两者比较
A.共同点
B.不同点
C.选择方法的因素
正文：
免疫组化是一种免疫学技术，通过使用特定抗体来检测组织切片中特定抗原的存在。
这种技术通常用于诊断和治疗疾病，研究基因表达和细胞信号通路。
免疫组化可以提供有关分子在细胞和组织中的定位信息，以及它们在疾病中的作用。
免疫荧光是一种类似的免疫学技术，它使用荧光标记的抗体来检测特定抗原的存在。
与免疫组化不同，免疫荧光可以在活细胞和组织中进行。
这使得免疫荧光成为研究细胞功能和分子动态的理想方法。
免疫组化和免疫荧光之间的主要区别在于它们的应用和检测方法。
免疫组化通常用于检测组织切片中特定抗原的存在，而免疫荧光可以在活细胞和组织中进行。
此外，免疫组化使用化学方法来检测抗原，而免疫荧光使用荧光标记的抗体来检测抗原。
选择免疫组化或免疫荧光方法的因素包括研究目的、样本类型和实验设计。
例如，如果研究目的是检测特定抗原在组织中的定位，则免疫组化可能是更好的选择。
如果研究目的是研究活细胞中的分子动态，则免疫荧光可能是更好的选择。
总之，免疫组化和免疫荧光是两种常用的免疫学技术，它们都可以用于检测特定抗原的存在。
冰冻切片 免疫荧光组化
冰冻切片免疫荧光组化
冰冻切片和免疫荧光组化技术是生命科学中广泛应用的技术。
以
下是两种技术的简介：
1. 冰冻切片技术：冰冻切片是把组织或细胞快速冻结并切成薄
片的技术。
不同于石蜡包埋技术，冰冻切片不需要前期的化学处理和
固定，具有样品保留完整活性、切片速度快、质量高等优点。
冰冻切
片广泛应用于免疫荧光组化、原位杂交、基因组学等技术中。
2. 免疫荧光组化技术：免疫荧光组化技术是一种利用特异性抗
体对目标分子进行标记和检测的技术。
该技术在机体免疫学、病毒学、肿瘤学和神经科学等领域广泛应用，可用于检测病毒、肿瘤标志物、
蛋白质表达、分子相互作用等。
通过将免疫球蛋白标记荧光染料或酶
标记物质后，通过显微镜或荧光显微镜观察样品上的染色，并进行分析。
该技术具有灵敏、特异、可视化等优点，已成为生命科学研究中
必不可少的技术之一。
免疫组化,免疫荧光
免疫组化,免疫荧光
免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）和免疫荧光（Immunofluorescence，简称IF）是常用于研究细胞和组织中蛋白质分布和定位的实验技术。
免疫组化：免疫组化是通过使用特异性抗体来检测和定位组织切片中特定蛋白质的技术。
它包括将组织切片与特异性抗体结合，然后使用染色试剂使抗原-抗体复合物形成染色反应，从而可视化目标蛋白质的位置。
该技术常用于研究细胞分化、组织病理学和肿瘤学等领域。
免疫荧光：免疫荧光是利用荧光染料（荧光标记的二抗或直接标记的一抗）结合目标抗原的方法来检测和定位组织或细胞中的蛋白质。
通过特异性的抗体与目标蛋白质结合，然后使用荧光标记的二抗或直接标记的一抗与抗原-抗体复合物结合，使目标蛋白质在显微镜下产生荧光信号，以观察其位置。
免疫荧光技术广泛应用于细胞生物学研究、免疫学和医学诊断领域。
这两种技术在原理上非常类似，但在应用上有一些区别。
免疫组化主要用于固定的组织切片，可用于定量和定位分析。
而免疫荧光通常用于固定的细胞，可以提供更高分辨率的蛋白质定位信息，并可以进行多色荧光共标记以研究多个蛋白质的相互作用和定位。
无论是免疫组化还是免疫荧光，都依赖于合适的抗体选择和样本处理步骤来确保结果的准确性。
技术的选择应根据研究
的目的和样本的性质进行评估和决策。
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色步骤
免疫荧光染色是一种常用的免疫组化技术，用于检测特定抗原在细胞或组织中的表达和定位。
以下是免疫荧光染色的基本步骤：
1. 取得标本：获取需要检测的组织或细胞样本，可以是固定的组织切片或涂片，或者是固定的细胞。
2. 抗原解发：如果样本中的抗原被掩盖或结合得过于紧密，需要进行抗原解发。
可以使用酶解方法或热解方法来解发抗原。
3. 阻断非特异性结合：使用非特异性结合抑制剂，如动物血清、牛血清白蛋白或BSA，来阻止未特异性抗体结合到样本上。
4. 抗体染色：加入特异性一抗，即针对目标抗原的初级抗体。
留样本在4°C或室温下与一抗孵育一段时间，充分结合。
5. 洗涤：用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合的初
级抗体。
6. 加入荧光标记的二抗：使用经荧光标记的二抗，即反应在初级抗体上的特异性抗体。
留样本在4°C或室温下与二抗孵育
一段时间，充分结合。
7. 洗涤：再次用缓冲盐溶液或PBS洗涤样本，以去除未结合
的二抗。
8. 盖玻片和封片：将样本转移到载玻片上并加盖玻片，可以加入抗褪色剂来保护荧光信号。
9. 观察与记录：使用荧光显微镜观察标本，并记录所观察到的荧光信号的位置和强度。
以上是免疫荧光染色的基本步骤，具体步骤可能会因实验目的和设备的不同而有所变化。
免疫组化法和免疫荧光染色法的区别
免疫组化法和免疫荧光染色法是生物医学领域常用的实验技术，它们在细胞和组织的研究中扮演着重要的角色。
虽然它们都是用于检测特定蛋白在生物样本中的表达情况，但在操作方法、原理和应用范围上却有着明显的区别。
在本文中，我将深入探讨这两种技术的区别，并就其在生物医学研究中的应用进行全面评估，以期帮助读者更深入地理解并灵活运用这两种技术。
1. 免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织或细胞中特定蛋白表达的技术。
它的操作流程大致包括取材、固定、脱水、包埋、切片、脱蜡、抗原修复、蛋白质检测、染色和显微镜观察等步骤。
在实验过程中，首先需要将样本切片，并通过特定的固定、脱水和包埋步骤将其固定在载玻片上。
随后，利用抗原修复方法还原蛋白的空间结构，以便后续的免疫染色。
接下来，通过加入特定的抗体和标记物，可以对目标蛋白进行特异性染色，并最终通过显微镜观察蛋白在组织或细胞中的表达情况。
2. 免疫荧光染色法免疫荧光染色法是利用特定抗体与荧光染料结合，通过检测荧光信号的方式来标记和检测生物样本中的特定蛋白表达。
它的操作流程也包括取材、固定、脱水、包埋、切片等步骤，与免疫组化法的操作步骤较为类似。
不同的是，在免疫荧光染色法中，需要利用特定的荧光标记的二抗或荧光素-抗素进行染色，通过激光共聚焦显微镜等设备观察样本中荧光的分布情况，从而检测目标蛋白的表达位置和水平。
在应用范围方面，免疫组化法主要用于研究组织切片或细胞样本中特定蛋白的表达情况，可以定量地评估蛋白的表达水平和分布情况，适用于体内和体外实验样本。
而免疫荧光染色法由于其高灵敏度和高分辨率的特点，适用于细胞共聚焦显微镜观察，可以用于检测细胞中蛋白的定位、表达和相互作用等，是细胞生物学和免疫学研究中常用的技术手段。
在本文中，我主要介绍了免疫组化法和免疫荧光染色法的操作原理、步骤和应用范围，并就其在生物医学研究中的应用进行了全面评估。
通过对这两种技术的深入了解，我们可以更好地选择合适的技术手段，并在实验设计和结果分析中更加灵活地运用这些技术来开展生物医学研究。
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(1)光源
光源的亮度应根据荧光素的类型
选择。小功率汞灯可满足激励一般荧光染 料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率
超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，
引起球内水银蒸发，经过5～15min，球内
气压升至50～70标准大气压，此时达到最
高亮度，成为稳定工作状态。
(2)滤片系统 是荧光显微镜的重要组成部 分，是获得特定波长光，清晰的荧光影像 和发挥显微镜最佳性能之关键。了解滤片 性能，正确地选择滤片是观察荧光效应的 前提和必要条件。
1.仪器构成
(1)计算机系统：控制着机械，光学、声
学系统及各种外围设备。 (2)激光照射系统：氩离子激光器和声光 调节器。
(3)显微镜系统，它主要由倒置显微镜和共
聚焦系统组成。
(4)检测系统，由检测器，检测放大器等元 件组成。 (5)X－Y平台 (6)Z-轴步进马达
2.共聚焦成像原理
激光器发出的激光束经过光的扩
记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS 洗；石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS 洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，
湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。
(3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去Nacl结晶。 (4)pH9.0缓冲甘油封片。 (5)镜检
10min，无水乙醇，95％乙醇，85％乙醇，
75％乙醇各2min）。 3.PBS洗（磷酸盐缓冲液0.01mol/L pH7.4） 3×3min。
4.0.1%胰蛋白酶（100ml蒸馏水中加入
100mg胰蛋白酶，100mg氯化钙，用0.1N
NaoH调pH至7.6），37℃，消化30min。 5.0.01mol/L pH7.4 PBS洗3×3min。 6.兔抗人AFP1:50（用专用抗体稀释液稀释） 37℃，1h或室温4h，或4℃过夜。
2.荧光素的种类
(1)异硫氰酸荧光黄（FITC）：分子量
390D，最大吸收光谱为490～495nm，最 大发射光谱为520～530nm。呈现明亮的 黄绿色荧光，分子量389.4。
(2)四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC）是 罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收 光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，
2.间接法
是直接的重要改进，先用标记
的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结合， 随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结
合。
操作流程
(1)冰冻切片经固定，凉干后PBS洗；石 蜡切片脱蜡至水，PBS洗，酶消化，PBS
洗3×3min。
(2)适当稀释特异性一抗，37℃孵育1h， 或室温4h，或4℃过夜，PBS洗3×3min。
激光连续照射样品，由CCD摄像机记录下 照射点所发射的荧光，成像速度快。
4.参数的选择
基本参数：Confocal,pinhole,detector, PMT,Stepsize, X points, Y Points, scanstr,speed,LaserPwr,Auto zoom,pt等
5.观察荧光组化片时应注意哪些问题？ 6.非特异性荧光的消除方法有哪几种？
一、荧光的特征
分子都含有电子，电子在不停地运 动着。根据量子理论，运动着的电子可以
处于一系列不连续的能量状态中，电子遵
守一定的规则，要以从一个能级向另一能
级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定
能量的吸收或释放。
激发
当电子吸收能量跃迁到较高能级， 这个过程叫激发。
(3)荧光标记二抗适当稀释37℃ 30min，
PBS洗3×3min。
(4)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min。 (5)封片，镜检。
六、荧光显微镜检查方法
1.荧光显微镜
荧光显微镜是免疫荧
光组织化学的基本工具。它是由超高压光
源，滤片系统(包括激发和压制滤板)，光
学系统和摄影系统等主要部件组成，是利 用一定波长的光激发标本发射荧光。
有二种接收方式：①由光电倍增管（PMT） 把光信号转变成电信号；②利用电荷耦合 器（CCD）把光信号转变成电信号。
(2)成像方式 ①载物台运动成像：以直径
很小的激光束照射样品，照射点发出的荧
光信号经PMT变成电信号，然后载物台移动 到下一点，记录该点的荧光强度。该方法 无轴向像差，成像时间长；
②反射扫描成像方式，通过转动反射镜使
闭后必须在30min后才能再启动光源，一 天中应避免数次点燃光源。
(6)标本染色后应立即观察。
(7)荧光高度的判断标准，分四级“ －”
为阴性，“ ＋”为仅能见明确可见的荧光； “ ＋＋”为可见有明亮的荧光；“ ＋＋ ＋”为可见耀眼的荧光。
七、非特异性染色的消除方法 根据产生的原因采取适当的方法，常用方法： 1.动物脏器粉末吸收法 2.透析法 3.Sephadex G-50柱层析法 4.DEAE纤维素柱层析法 5.荧光抗体稀释法 6.纯化抗原方法 7.纯化抗体方法 8.伊文氏蓝衬染方法：0.01%伊文氏蓝
荧光信号增强封片剂 mowiol 40-88 甘油 蒸馏水 4.8g 12ml 12ml
0.2mol/L Tris(pH8.5) 24ml
上述混合（加热溶解），5000g离心， 15min，最后加入1.4-diazobicydo[2,2,2]-octane(DABcos)，终浓度 2.5%(约1.25g)，溶解后，分装存于20℃中。 (5)镜油
滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热 滤片，分光镜和其他一些中性滤片。
荧光显微镜的滤片系统
激励法 分光镜 U 激发滤光片 截止滤光片 用途 BA420 自动荧光观察法，DAPI(联脒基吲哚)：DNA Hoechest 33358,33342染色体 DM400 BP330-385 BP360-370
八、激光扫描共聚焦显微镜
激光扫描共聚焦显微镜(laser
scanning confocal microscope,LSCM) 是80年代发展起来的一项具有划时代意 义的高科技新产品。
实现了对细胞内部非侵入式光学断层 扫描成像，从而对被检物体样品从停留到 表面单层，静态平面的观察进行到立体， 断层扫描、动态全面的观察，在生命科学 研究中得到迅速应用。
发射
以辐身方式跃迁时，能量转化成相
应波长的光，这个过程叫发射。
荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单
重激发态。如果电子直接从单重激发态以
辐身方式跃迁到基态，由于单重激发态很
不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也 很短，这种发射光，叫荧光。
二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物
称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的 光能并发射荧光。
(5)Ca2+、pH及其他细胞内离子的实时定 量测定 (6)粘附细胞的分选
(7)激光细胞显微外科及光陷阱技术
(8)荧光光漂白恢复（FRAP）技术
(9)胞间通讯的研究 (10)细胞膜流动性测定 (11)光活化技术
实习1
免疫荧光组化----间接法
1.4 µ m石蜡切，58℃烤，18h。 2.常规脱蜡至水（二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各
三、荧光素标记抗体的方法
(一)FITC标记抗体的方法 1.Marsshall法 (1)原理：当FITC在碱性溶液中与抗体反应 时，主要是抗体分子上的赖氨酸ε -氨基与
FITC上硫碳胺键结合，一个IgG分子中有86
个赖氨酸残基，一般最多能结合15～20个。
荧光素FITC-N＝C ＋ N-蛋白质→ ‖ S H H FITC- N – C – N - 蛋白质 ‖ H S H
3.改良法
4.透析标记法
（二）四乙基罗达明标记抗体方法
（三）藻红蛋白标记抗体方法
四、荧光抗体的质量控制
主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。
1.特异性染色效价测定 2.非特异性染色测定 3.吸收试验 4.F/P比值的测定方法
五、免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法 简便、快速，用已知特异性标
3.使用荧光显微镜注意事项
(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。 (2)应在暗室中进行检查。 (3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源 时应戴上防护眼镜。
(4)检查时间每次以1～2h为宜，超过90min，
超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。
(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集 中检查，以节省时间，保护光源。光源关
5.性能特点：分辨率高，灵敏度高，扫描
速度快，扫描范围大，图像存取方便，可 进行光切片的观察，可进行定量荧光分析。
6.应用
(1)组织光学切片
可对活的或固定的细
胞及组织进行无损伤的系列“ 光学切 片”，得到其各层面的信息-“ 显微CT”。 (2)三维图像重建
(3)细胞物理和生物化学测定
(4)荧光的定量、定位分析
IB G
DM505 PB460-490
BA515IF BA590 罗丹明 四甲基罗丹明异硫氰酸盐：荧光抗体观察 碘化丙啶：DNA
BP470-490
DM570 BP510-550 BP530-550 BP480-550
IG
DM565 BP520-550
DM600 BP545-580
BA580IF
BA610IF 德克萨斯红：荧光抗体观察
2.标本制作要求
(1)载玻片厚度应在0.6～1.2mm之间
(2)盖玻片应光洁，厚度在0.17mm左右 (3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消 耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部 不能充分激分。
(4)封片剂
常用甘油，必须无自发荧光，
无色透明，荧光的亮度在pH8.5～9.5时较 亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L pH9.0～9.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封 片剂。
V
BV
DM455 BP400-410