免疫组化技术常见问题和处理方法
免疫组化技术要点与常见问题
免疫组化技术要点与常见问题在免疫组化过程中，为了更好的说明问题和查找原因，最好设置阳性对照片（已知的高表达相应抗原的组织）和阴性对照组织片（不加一抗但是加二抗系统/不加任何抗体两组），所有操作过程应完全一致。
染色弱或者没有染色（按照先后顺序，先排除一些简单的原因）:可能原因解决办法试剂使用顺序错误或者漏加试剂重复实验，保证每一步均正确二抗和一抗不匹配选择匹配的二抗底物和酶不匹配选用匹配的底物酶失活换用新的酶（将酶和底物混合，看是否显色？）组织中没有待测抗原表达或者表达水平低使用阳性对照片抗体浓度太低增加抗体浓度.最好使用不同浓度的抗体，决定最佳浓度抗体孵育时间不充分延长抗体孵育时间底物孵育不充分延长底物孵育时间抗体储存不当，导致失效将抗体分装，低温保存 (-20 to -70 C) ，避免反复冻溶。
稀释抗体在4保存1-2周，避免时间过长。
或者根据说明书进行恰当的保存一抗失效换用新的一抗二抗失效换用新的抗体（能否成功与其它一抗配合？）脱石腊不充分延长脱腊时间或者换用新的二甲苯组织固定不充分或者不当增加固定时间或者改用不同的固定方法组织固定过度减少固定时间。
若已固定过度，则需使用正确的或者推荐的抗原修复方法复染试剂与底物系统不匹配选择正确的复染试剂（不加复染剂，看是否有组织染色？）封片剂不正确选择正确的封片剂染色背景高:可能原因解决办法洗片不充分每步之间至少洗片3次组织含有内源性的酶，如HRP/AP 在加入一抗之前使用3％的H2O2甲醇封闭内源性HRP 活性，使用左旋咪唑(levamisole)溶液阻断内源性AP活性。
或者换用葡萄糖氧化酶系统组织含有内源性生物素（尤其是肾脏、肝和脾）在加入一抗之前，血清封闭之后使用avidin/biot in阻断试剂。
或者避免使用biotin-avidin系统或改用IF方法(直接将酶和底物加到组织片上，看是否显色？)一抗的非特异性结合或者抗体浓度过高增加一抗的稀释度二抗和组织非特异性结合使用与二抗来源相同的正常动物血清（一般是1 0％）封闭，必要时可以将血清浓度加大组织固定不充分，抗原扩散Increase duration of postfixation使用小鼠来源的二抗检测小鼠组织在加一抗之前使用MouseOnMouse封闭试剂干片染色过程中避免出现干片现象染色强度过大:可能原因解决办法一抗或者二抗浓度过高降低抗体浓度。
免疫组化技术常见问题及处理方法ppt课件
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
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固定不充分
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标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组
免疫组化技术
常见问题及处理方法
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免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些 化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定 位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免 疫细胞化学技术
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免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
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6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
免疫组化经验总结第一部分步骤及常见问题
免疫组化经验总结第⼀部分步骤及常见问题免疫组化技术流程及常见问题解析（修改版）说明：加粗的字体部分是我认为要注意的地⽅和提出的问题，⽽红⾊字体部分表⽰还不太确定的第⼀部分载玻⽚与盖玻⽚的处理：载玻⽚与盖玻⽚重铬酸钾浸泡1-2天，⽔清洗直到没有颜⾊为⽌，放⼊⽆⽔⼄醇中，⽤纱布擦⼲（如需开展原位杂交，还需将玻⽚240℃烤2h），载玻⽚涂上多聚赖氨酸，37度烘⼲，备⽤第⼆部分冰冻切⽚前期处理1冰冻切⽚组织处理。
肿瘤组织从体内取出后，迅速放于液氮中冰冻，然后放于－８０度保存，切⽚时先⽤OCT 固定（尽量减少⽓泡⽣成），-20度20-30分钟固定好后即可切⽚（最好时间长⼀点，时间太短容易使切⽚卷起，也使切⽚不均匀）。
2切⽚，切⽚时要慢，稳⼀点，切好后⽤涂有多聚赖氨酸的载玻⽚粘取切下的组织⽚，粘的时候有⼀个向内拉伸的动作，这样可以使组织⽚充分展开。
⽚⼦的厚度⼀般为10um,也有的要切30um（根据需求调整）。
切好的⽚⼦⽴即放⼊4﹪的新配的多聚甲醛中处理8-10分钟(或在丙酮中固定10S，具体⽤什么固定要看⼀抗的要求)3 PBS中洗⼀下（约2分钟）去掉残留的多聚甲醛。
（丙酮切⽚的话省去本步骤）（从冰箱中取出的⽚⼦最好在PBS中浸泡2分钟，再往下做。
如果打孔不充分，可以在PBS 中加⼊triton x-100洗三次。
再⽤PBS洗⼏次，除去triton x-100）4 ⽚⼦切好后可放于37度烘⼲，但是时间不要太长，2-3⼩时即可，或者室温风⼲，然后放于-20度或-80度冰箱可长期储存。
但是⽤丙酮或有机溶剂固定的⽚⼦上如果还有其他有机溶性的染料的话建议尽快做掉，因为有机溶剂在长期储存中（⼀个⽉）缓慢作⽤的话，也会使染料变得模糊。
第三部分加抗体5 10％正常⼭⽺⾎清（PBS稀释，可加少量的triton x-100打孔），封闭（依⼆抗的来源⽽定），室温孵育30分钟。
6倾去⾎清，擦⼲各组织之间的⽔滴，防⽌有⽔滴粘连。
滴加适当⽐例稀释的⼀抗1：100左右或⼀抗⼯作液，37℃孵育1~2⼩时或4℃过夜，4℃过夜后需在37℃或室温复温30分钟。
免疫组化染色常见问题及解释
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。
因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
免疫组化技术常见问题及处理方法
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不 足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加 抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以 提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着 色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织 处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保 其性能稳定、准确可靠。同时， 对设备进行日常维护，及时排除 故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验 结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免 试剂受潮、光照、高温等不利因素的 影响。关注试剂的有效期，避免使用 过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构 和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和 固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。 同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
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仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫 组化实验准确性的关键环节。
详细描述
详细描述
为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立 统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、 交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议 和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通 过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进 步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
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免疫组化实验步骤及常见问题分析
免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验步骤及常见问题分析免疫组化实验流程1.样品制备2.组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定3.组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构4.切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态5.脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。
脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。
6.抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。
可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。
7.非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。
封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。
8.样品染色一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。
在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。
二抗一般室温孵育30min。
底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。
复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。
观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。
免疫组化实验常见问题分析1. IHC实验结果显色过深一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间孵育温度过高——选择4℃或室温孵育2. 实验结果存在非特异性显色石蜡切片脱蜡不够——延长脱蜡时间蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭3. 实验结果显色弱或无染色一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间组织中无目的抗原的表达：一抗种属来源与二抗不匹配免疫组化实验注意事项切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。
免疫组化常见问题及解决办法
组化常见问题及解决办法当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
②切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
非特异性染色① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
②一抗的使用浓度是否过高。
③清洗是否充分。
应严格操作规程。
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免疫组化对照和质量控制
• 阳性对照 • 阴性对照 • 免疫组化的标准化 • 外部质量控制体系
脱水、透明、封片、拍照
• 脱水、透明要彻底 • 封片时尽量避免留有气泡 • 拍照尽量在两周内 • 拍照尽量选择干净、清晰的视野，无杂质无破碎
组织 • 所拍照片尽量在同一种状态下，使背景保持一致 • 照片标识清楚
片架放进沸腾的修复液时需轻柔
背景染色较深的原因
• （1）抗体浓度过高：一抗浓度过高是常见的原 因之一。解决办法是，每次使用新抗体前应当对 其工作浓度进行测试，使每一抗体个体化，找到 适合自己实验室的理想工作浓度
• （2）抗体孵育时间过长或温度较高：解决办法 是，严格执行操作规程，避免因遗忘而造成时间 延长。时间和温度要根据染色结果进行调整
9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。
10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明， 中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接 用水性封片剂封片。
二步法(Envision系统)
• 1）脱蜡、水化组织切片。 • 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 • 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧
免疫组化染色的评分
乘积法：
强度： 0分 无色 1分 淡黄色 2分 棕黄色 3分 棕褐色
细胞数: 0分 无 1分 ≤10％ 2分 11－50％ 3分 51－75％ 4分 >75％
两者乘积>3分为阳性。
免疫组化染色的评分
阳性细胞数的百分比： (+) 阳性细胞数<25% (++) 阳性细胞数>25%,<50% (+++) 阳性细胞数>50%,<75% (++++) 阳性细胞数>75%
素等的二抗进行反应 • 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，
在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成 分的分布和含量
免疫组织化学的分类
• 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、 荧光标记和放射性标记等
• 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间 接法的灵敏度提高了许多
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
固定不充分
标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致
• 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物 酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵 白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等
• SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型 二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高 的组织抗原检测
可被检测的物质
• 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进 行检测
免疫组织化学的特点
• 1）特异性强 • 2）敏感性高 • 3）定位准确、形态与功能相结合
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
免疫组织化学方法的基本步骤
• 组织和细胞的处理 • 抗原修复 • 染色
鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）
鼠单克隆抗体Leabharlann • 特异性较高 • 背景较干净 • 有多种潜在用途 • 但敏感性、亲和力低
兔多克隆抗体（兔抗血清） • 高敏感性、亲和力 • 可能有较多的交叉反应 • 更多的潜在用途
SP法
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μ l过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μ l生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μ l链霉菌抗生物素-过氧化物酶 溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μ l新鲜配制的DAB或AEC溶液， 显微镜下观察3-10分钟。
• （3）DAB变质和显色时间太长：DAB最好现用 现配，如有沉渣应进行过滤后再用。配制好的 DAB不应存放时间太长，DAB的显色最好在显微 镜下监控，达到理想的染色程度时立即终止反应
• （4）组织变干
• （5）切片在缓冲液或修复液中浸泡时间太长 （大于24小时）
• （6）一抗变质、质量差的多克隆抗体
组织发硬发脆 • 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷， 而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片
标本的切片、捞片、烤片
• 切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细 胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想
• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～ 50℃）
免疫组化技术
常见问题及处理方法
免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某 些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、 定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或 免疫细胞化学技术
免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
• 酶消化： 如胰蛋白酶、蛋白水解酶 • 热抗原修复（HIER）：
水浴；微波炉；高压锅；高压消毒锅；蒸汽室 • 超声波 • 以上综合运用
• 修复方法从强到弱为：高压修复、微波修复、胰酶修 复
热抗原修复
• 更有效：染色结果更一致，操作更单一 • 事先确定的热修复时间可适用于几乎所有的组织 • 一抗可以进一步稀释（节省费用） • 有些抗体只有采用热抗原修复才有效
阻断内源性生物素的方法
组织在热修复之后，用3％的新鲜H2O2进行封闭， 以 阻断内源性过氧化物酶的活性，室温下孵育10min， 再用10％鸡（鸭）蛋清阻断10～15分钟，清洗后滴加 一抗
应用非生物素系统的检测试剂盒，如EnVision系统
热抗原修复的缓冲液
• pH6.0 柠檬酸缓冲液（最常用）、尿素、Tris-HCl、商品 化修复液等
• 温度有 4 度、室温、37度，其中4 度最佳，反应 最温和，背景较浅；而 37度反应速度较快，时间 较短；室温不太提倡
• 4度过夜和从冰箱拿出后需37度复温45min
复温的必要性
• 防止切片从4度直接放入PBS易脱片
• 使抗原抗体结合更稳定 4度和37度时分子运动方式不同,前者分子碰撞机 率和运动速度小于后者,后者结合更快,但敏感性 也提高了并易造成非特异染色
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
抗原修复
• 概念:应用物理或化学的方法将组织固定过程中
封闭的抗原决定簇修复暴露的过程称为抗原修复
• 原因：甲醛固定过程中形成醛键和羧甲基而封闭
部分抗原决定簇，固定时，蛋白与蛋白之间发生 交联,可能会封闭抗原决定簇
抗原修复的方法
希望提出指导与建议
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
• 碱性 pH 修复液常对绝大多数抗体的效果更好
• 推荐使用：EDTA缓冲液 pH 8.0或Tris-EDTA缓冲液pH 9.0 是较好的常规修复液，可用于大多数热修复有效的抗体
抗体孵育条件
• 主要抗体浓度、温度、时间，三者一般是相互成 反比的（相对）
• 浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度， 时间决定反应的量
脱片产生的原因和如何防止脱片
• 多聚赖氨酸玻片的质量问题 • 切片问题：切片较厚或者不均匀 • 组织本身的问题：癌症组织中坏死组织越多越容
易脱片 • 烤片的时间短、温度不够 • 操作的时候甩的过猛，有脱片嫌疑的片子最好不
甩或轻轻甩，用吸水纸从边缘上慢慢吸水 • 修复的问题：抗原修复的时候高压时间过长，玻
热抗原修复：注意事项
• 无论哪一步都不要让切片干涸（抗原可完全丢失） • 加热后需要冷却15～30分钟（个别未折叠的蛋白链
恢复到原来的构型）
热抗原修复存在的问题
• 过度的热修复会导致组织形态的破坏或组织完全消 化，免疫染色变弱或定位不准确
• 有一个时间点，超过这个时间点进一步热修复也不 会获得更强的染色效果
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱