免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法ppt课件
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
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固定不充分
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标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组
免疫组化技术
常见问题及处理方法
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免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些 化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定 位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免 疫细胞化学技术
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免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
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6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
免疫组化病理技术质量控制问题及对策分析
免疫组化病理技术质量控制问题及对策分析摘要：目的：研究免疫组化病理技术质量控制问题及对策。
方法：选择2020年01月－2021年12月到本院接受免疫病理诊断的患者50例，对全部患者实施常规病理免疫组化制片、免疫组化病理技术质控管理后制片。
结果：实验组总有效制片率49（98.00%）高于对照组37（74.00%），P＜0.05。
结论：运用免疫组化病理技术对疾病诊断价值较高，更需探析质量控制存在的问题，分析相关对策。
关键词：免疫组化病理技术；质量控制；问题；对策免疫组化病理技术是目前临床比较普遍运用的一种病理检测技术，此技术的运用可提高病理诊断准确度。
但需意识到，此种技术的运用对技术和操作技能要求高。
若是检测中任意一环发生问题，都会严重地影响到制片的效果。
为了保障免疫组化病理诊断的准确度，操作流程要按照病理流程开展，使得免疫组化流程更为科学。
这就需重点对技术质量控制，探析质控存在的问题，依照问题分析解决对策，旨在提升制片质量和有效概率[1]。
基于此，本文将分析免疫组化病理技术质量控制问题及对策，报道如下：1.一般资料与方法1.1一般资料选择2020年01月－2021年12月到本院接受免疫病理诊断的患者50例，对全部患者实施常规病理免疫组化制片、免疫组化病理技术质控管理后制片，患者平均年龄（46.14±2.31）岁，一般资料（P＞0.05），探析质控问题和解决对策，评估诊断价值。
1.2方法两组内患者均选取相同的实验试剂，其中包含：甲醛、无水乙醇、二甲苯、伊红染液、苏木素染液、DAB液等。
运用莱卡RM2235组织切片设备、樱花Tissue_TekVIP5Jr智能环保生物组织脱水设备、恒温干燥箱设备以及生物组织摊烤片机设备。
全部标本都接受常规的脱水处理、浸蜡处理以及包埋后切片处理等等，标本面积需控在1.5×2cm，切片厚度4—6um。
对照组操作是传统的切片操作，而实验组操作是质量控制之后的切片操作。
免疫组织化学染色过程中出现问题及对策
1941年co ons首先用荧光素标记抗体,检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功,从而创建了免疫组织化学技术。
经过60余年的不断发展,由最初的直接免疫荧光标记法,逐渐发展出现了间接法,免疫酶法,免疫胶体金法,酶标记复合法等等。
该方法的敏感性和特异性不断得到提高,使其成为医学和生命科学领域中研究组织形态、功能和代谢的一项有力工具[1—3]。
随着该技术应用的普及和深入,免疫组织化学(免疫组化)染色技术作为病理诊断的主要辅助手段,各种新技术的引入以及新抗体相继问世,使免疫组织化学技术得到了更广泛的推广和应用,为临床病理诊断、肿瘤性质的判定、预后的估测等提供了重要依据。
但是,由于影响其操作的因素较多,免疫组化质量不稳定常常困扰着免疫组化工作人员。
本文举出了一些染色过程中出现的问题,并分析其中可能原因。
1.阴性反应染色结束后,切片中见不到任何阳性信号。
排除掉组织或细胞中确实不表达与抗体相关的抗原的原因外,还可能是染色过程中的某一或某些环节出了问题,出现了假阴性结果。
可能原因如下:1.1操作失误有的组织必须经过抗原修复才能检测抗原表达,却未进行抗原修复[1,2];或选用了只能用于冰冻组织而不能用于石蜡包埋组织的抗体;或一抗失效,也可见于染色过程中漏掉了某一环节;还可能是所选用的检测系统与一抗不匹配,如选用的一抗是兔源性抗体,二抗错选了抗鼠源性抗体。
解决办法:在三抗孵育结束时,将切片上的三抗滴在一张白纸上,再将配制好的DAB滴在白纸的三抗上,观察是否出现棕色。
如果出现了,证明三抗和DAB的配制过程正确。
如果不出现棕色反应,则三抗或DAB的配制过程有误。
1.2假阴性造成假阴性结果的因素一般来自三方面:1.组织处理不当,抗原损失过多或被遮蔽;2.抗体(包括特异性一抗和标记抗体)失活,效价过低或稀释度不合适;3.染色步骤的差错或其他试剂的问题,如显色剂、缓冲液的离子强度及ph值[3]。
解决阴性染色的问题,需要设立“阳性对照”和“阴性对照”。
免疫组化染色常见问题及解释
一、为达到免疫组织化学技术的要求，组织固定越新鲜越好。
在免疫组化最后结果的判断时，常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象，经多方研究认为，它是一种假性非特异性的染色。
因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散，肿瘤细胞无限制的生长和生长过速，导致肿瘤中间部分组织血液供给困难，造成缺血坏死，坏死细胞中的抗原由于机体的作用，可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质，这是抗原发生弥散的一种方式。
另一种抗原弥散的方式就是，由于组织没有及时的固定所引起的。
离体的组织不及时固定，组织就会自溶，抗原就会扩散，这是一非常普通的常识，但要做好却是极不容易。
标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间，在这段时间里，有的抗原就可以发生扩散。
虽然已浸入了固定液，但标本较大，固定液的量又不足，当然由于固定液的渗透需要时间，当渗入到组织之中时，中间的细胞已发生了变化，抗原也随着发生扩散，这种现象在产酶多的器官是比较明显的，如胃癌，当切除后标本较大，虽然在手术室期间已放入了固定液，但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间，当固定液发挥作用时，组织已经发生变化。
因此，这了达到免疫组织化学染色的要求，对于离体的组织尽量快的进行固定，有条件的应将其剖开，早取材，早固定。
二、组织脱水必须彻底干净组织块取材不能太大过厚，才能较好地完成脱水的过程。
如果取材太厚，在较短的时间内脱水不完全，将可引起一系列的问题，比如浸蜡不彻底，切片不好完成，切不完整。
由于先天不足，导致后来切片染色的脱落，造成染色的失败，或者由此反复操作，造成年人力物力的浪费，造成病理报告的延期发出等。
因此，对取材的要求是除了要求要有艺术性外，即平整、外观好看，还要求适中。
三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折应用于免疫组织化学染色的切片，对切片的质量要求较高，切片必须完整，平展、无汽泡，无邹折，这样有利在染色时的冲洗，有利于切片的牢固附贴。
如果切片不平展，免疫组化染色后，可出现染色不均匀的现象，颜色深浅不一，不平。
免疫组化技术常见问题及处理方法
染色弱或无信号问题可能是由于抗体浓度过低、孵育时间不 足、组织抗原量少等原因所致。为解决这一问题，可以增加 抗体浓度、延长孵育时间、增强组织抗原的暴露等措施，以 提高染色强度。
染色背景问题
总结词
染色背景是指染色结果中除了目标蛋白外的其他染色，通常表现为整个视野的弥漫性着 色。
详细描述
染色背景问题可能是由于抗体与组织中其他蛋白的交叉反应、组织内源性酶活性、组织 处理过程中产生的物质等所致。为解决这一问题，可以采取使用阻断剂、降低抗体浓度、
定期对仪器设备进行校准，确保 其性能稳定、准确可靠。同时， 对设备进行日常维护，及时排除 故障，保证实验的正常进行。
试剂储存和有效期问题
总结词
试剂的储存和有效期直接关系到实验 结果的可靠性。
详细描述
严格按照试剂说明书进行储存，避免 试剂受潮、光照、高温等不利因素的 影响。关注试剂的有效期，避免使用 过期试剂。
详细描述
固定和保存组织的目的是为了保持组织结构 和抗原性。不同的组织需要不同的固定液和 固定时间，以确保抗原的完整性和稳定性。 同时，组织的保存条件也需严格控制，以防
抗原丢失或降解。
04
仪器设备和试剂问题
仪器设备校准和维护问题
总结词
仪器设备校准和维护是确保免疫 组化实验准确性的关键环节。
详细描述
详细描述
为了促进免疫组化技术的数据共享和交流，需要建立 统一的数据库和平台，以便研究人员能够共享数据、 交流经验和技巧。此外，应鼓励研究人员在学术会议 和期刊上发表研究成果，促进技术的传播和应用。通 过加强数据共享和交流，可以推动免疫组化技术的进 步和创新，提高其在医学研究中的应用价值。
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免疫组化常见问题及解决办法
组化常见问题及解决办法当免疫组化染色没有出现预期结果时，应系统地查找原因，而每一次只能排除一种可能的原因。
对照/标本无染色① 确认是否忽略了应该加的某种试剂，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 确认所有的试剂是否按正确的顺序加入，是否孵育了足够的时间。
③对照抗体的标签确认是否使用了正确的抗体，以及所用的检测系统是否和一抗匹配，这一点是非常重要的。
比如，如果一抗是兔来源的抗体，二抗一定要用抗兔的二抗来匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必须是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 检查抗体所使用的稀释度及稀释溶液。
⑤ 检查抗体的有效期和保存条件，尤其是标记了酶或荧光素的抗体，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。
⑥ 检查标本的储存条件，最好用已知阳性的标本来同时做阳性对照。
弱阳性如果阴性对照没有染色而阳性对照标本弱阳性，除了考虑上述因素外，还应考虑：①不适当的抗原修复方式，由于石蜡切片在制作的过程中固定剂对抗原的封闭作用，必须用抗原热修复或酶消化或两种同时使用的抗原双暴露法，至于使用哪一种方法，应参照生产厂家的说明，同时结合标本的具体情况而定。
②切片上遗留了过多的冲洗液，当抗体加至切片上时，等于人为地对抗体进行了进一步的稀释。
③ 抗体的稀释度是否过高或者孵育的温度/时间是否正确。
一般试剂生产厂家都会对试剂给出一定的使用范围，但是由于使用者的标本来自各种组织，处理过程也不尽相同，所以应参照使用范围，对所使用的一抗进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。
④孵育时切片是否放置水平，否则会导致抗体流失。
非特异性染色① 是否有效地去除了内源性酶和生物素。
应注意的是，并不是每一种组织均需要进行此步骤，但对于内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑此原因。
②一抗的使用浓度是否过高。
③清洗是否充分。
应严格操作规程。
免疫组化关键步骤常见问题和解决方案范文
免疫组化关键步骤常见问题和解决方案范文精品论文参考文献1.3脱蜡至水洗中应注意的问题脱蜡液应经常更换，必须保证脱蜡干净，彻底，水洗充分，水洗之后切片应放在蒸馏水中清洗1～2遍，脱蜡不干净，不彻底时，就会出现非特异性着色，影响染色效果，即阳性强度也会减低。
1.4抗原修复中应注意的问题目前常用的抗原修复液有两种：即0.01M柠檬酸缓冲液（PH6.0）和1mM的EDTA缓冲液（PH9.0或PH8.0）.对于一些胞浆阳性或胞膜阳性的抗体，选择柠檬酸缓冲液比较好，而对于一些胞核阳性的抗体，选择EDTA缓冲液比较好。
配置修复液时必须用蒸馏水，否则染色会失败，大部分抗体都会出现假阴性。
抗原修复方法目前比较常用的是高压锅喷气2～3分钟，中火（120℃～140℃）。
自然冷却，如果要节省时间，可用自来水冲洗高压锅外面，等到压力降下，再把高压锅锅盖打开，放在冷水中冷却，中途可换一次水，这样既节省用水，又可节约时间，等到高压锅中水温接近常温，就可直接用自来水冲洗切片[1]。
1.5滴加抗体前和滴加抗体时应注意的问题切片冲洗好后，应放在蒸馏水中，拿出画圈，画圈时应注意圆圈与组织必须保持一点距离，否则会产生边缘效应，即圆圈旁组织会产生非特异性染色。
画好圈后，用PBS冲洗切片，注意画完圈后尽量不要让切片干燥，画完圈后也不能立时冲洗，要等油干燥后再冲洗，否则油就冲掉了，就不能起到防止抗体外溢的效果。
用蒸馏水配置PBS时，需加一些吐温或去垢剂，有利于冲洗的更干净，也有利于滴加完抗体后抗体的弥散速度，抗体弥散速度快，操作简便，节约时间。
一抗孵育可选择37℃温箱1小时或4℃冰箱过夜，而二抗的孵育一般都是室温，添加二抗前和显色前，PBS都必须彻底冲洗干净，否则会产生非特异性着色。
1.6显色时应注意的问题在保证显色液配制浓度准确的情况下，显色时间应严格把握。
当制作大批切片时，可以批量滴加显色液，先用肉眼观察组织是否变黄，若变黄时，可在镜下控制，每种抗体的显色时间，背景着色能都不太一样，具体可在镜下控制，积累经验。
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结
免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。
如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。
就拿温度来说，可以有4度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。
2、免疫组化最大的优势是定位和定性。
相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。
尤其对于有些因子的转位研究十分有用。
3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。
免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。
4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。
阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。
前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。
5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。
如今发SCI论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。
当然也不能做假阳性或假阴性结果。
6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。
我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。
失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。
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免疫组化技术常见问题及处理方法
Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
免疫组化技术常见问题及处理方法
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
免疫组化技术常见问题及处理方法
SP法
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
免疫组化技术常见问题及处理方法
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
TBS浸洗3分钟×5次。 • 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸
洗3 分钟×5次。 • 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵
免疫组化技术常见问题及处理方法
可被检测的物质
• 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进 行检测
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组织化学的特点
• 1）特异性强 • 2）敏感性高 • 3）定位准确、形态与功能相结合
素等的二抗进行反应 • 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，
在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成 分的分布和含量
免疫组化技术常见问题及处理方法
免标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、 荧光标记和放射性标记等
• 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间 接法的灵敏度提高了许多
免疫组化技术
常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些 化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定 位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免 疫细胞化学技术
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
免疫组化技术常见问题及处理方法
• 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物 酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵 白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等
• SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型 二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高 的组织抗原检测
9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。 10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，
中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接 用水性封片剂封片。
免疫组化技术常见问题及处理方法
二步法(Envision系统)
• 1）脱蜡、水化组织切片。 • 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 • 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
免疫组化技术常见问题及处理方法
固定不充分
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组织化学方法的基本步骤
• 组织和细胞的处理 • 抗原修复 • 染色
免疫组化技术常见问题及处理方法
鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）
鼠单克隆抗体 • 特异性较高 • 背景较干净 • 有多种潜在用途 • 但敏感性、亲和力低
兔多克隆抗体（兔抗血清） • 高敏感性、亲和力 • 可能有较多的交叉反应 • 更多的潜在用途
免疫组化技术常见问题及处理方法
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶 溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液， 显微镜下观察3-10分钟。
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
免疫组化技术常见问题及处理方法
标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组