免疫组化技术-实用篇
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是现代生物学研究领域中一项重要的实验技术，它通过利用抗体与特定抗原的高亲和力结合特异性标记，可以准确地检测和定位分子在细胞和组织中的分布，并在这一基础上进行生物学功能的研究。
本文将对免疫组化技术的原理、应用以及发展趋势进行详细介绍。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术基于生物体对抗原与抗体的免疫反应，利用抗体与抗原的特异性结合来标记和检测感兴趣的分子。
免疫组化技术的关键步骤包括：抗原的固定、抗原的暴露、与抗原的特异性结合和信号检测等。
在免疫组化技术中，抗原通常需要进行固定，以保持其在组织中的形态和位置不变。
一般来说，抗原可通过形成固定化复合物或被共价结合到载玻片或膜上。
随后，我们需要将抗原从组织中溶出，以使其暴露于抗体。
这一步骤通常涉及脱水、脱脂和脱钙等处理。
暴露后的抗原可以与特异抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
为了标记抗原-抗体复合物，我们需要选择适当的检测系统。
目前常用的检测方法包括荧光染色、酶学染色和放射性标记等。
其中，荧光染色技术具有高灵敏度和分辨率，能够利用荧光显微镜直接观察标记物的分布。
二、免疫组化技术的应用免疫组化技术在许多研究领域中广泛应用。
在医学领域，它常用于研究肿瘤形成机制、诊断和预后判断。
通过免疫组化技术，我们可以检测和定位许多肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）和肿瘤相关抗原（CA）等，从而帮助医生进行早期诊断和治疗。
在神经科学领域，免疫组化技术被广泛用于研究神经元发育、突触形成和神经退行性疾病。
通过标记神经元特异性蛋白质，如神经元特异性烯醇化酶（NSE）和神经纤维酸性蛋白（NF）等，可以清晰地观察和研究神经元的结构和功能。
此外，免疫组化技术在细胞和分子生物学研究中也具有广泛的应用。
通过对细胞内蛋白质、DNA和RNA等分子的定位和检测，我们可以研究细胞的生物学功能和基因调控机制。
例如，通过检测特定蛋白质的表达和定位，可以研究调节细胞周期和细胞分化的信号通路。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（immunohistochemistry, IHC）是通过对组织切片进行染色，利用免疫反应性的抗原抗体反应，以检测和定位组织切片中的特定抗原或蛋白质的技术。
免疫组化在临床病理学和研究中被广泛应用，可以提供有关疾病诊断、病理机制研究、分子分型和药物靶向治疗等方面的信息。
1. 抗原修复（antigen retrieval）：抗原修复是为了使组织样本中的目标抗原或蛋白质恢复到免疫表位充分暴露的状态。
组织切片有可能存在形态学变化、组织化学改变、酸碱性改变或氧化还原状态的变化，这些变化导致了抗原稀释或失活。
抗原修复的方法通常包括热敏抗原恢复和酶消化抗原恢复。
热敏抗原恢复是将组织切片放置在高温缓冲液中，以恢复抗原的形态和免疫活性。
酶消化抗原恢复是通过酶的消化作用，破坏组织切片中的蛋白质交联结构，使抗原恢复活性。
2. 阻断（blocking）：阻断是为了防止非特异性背景信号的产生。
在进入下一步的抗体孵育之前，使用非特异性的蛋白质来覆盖未被抗体结合的区域，防止后续过程中非特异性背景信号的形成。
通常使用的非特异性蛋白质包括牛血清蛋白、羊血清蛋白、鱼胶蛋白等。
3. 一抗孵育（primary antibody incubation）：在这一步骤中，使用特异性抗体与目标抗原或蛋白质结合。
抗原抗体反应是免疫组化的核心步骤，这一步骤的可靠性和特异性对结果的准确性和解释性起着至关重要的作用。
选择合适的一抗对研究目的至关重要，一抗通常通过免疫荧光标记、酶标标记或生物素标记等方式来实现。
4. 二抗孵育（secondary antibody incubation）：在这一步骤中，使用抗一抗体结合免疫球蛋白和抗体复合物。
一抗与目标抗原结合后，二抗与一抗的Fc区结合，从而形成一个抗原-一抗-二抗复合物。
二抗通常标记有酶（如辣根过氧化物酶-HRP）、荧光物质（如荧光素酶）或生物素等。
5. 显色反应（color development）：根据标记的二抗的性质，选择合适的显色方法。
免疫组化技术演示文稿
特定的糖基。另外，凝集素具有多价结合能力，能与荧光素、生物素、
酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示其结 合部位
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（二）凝集素在免疫组织化学中的应用 由于凝集素的以上生物学特性，目前已广泛应用作为细胞 分化和成熟的标记、细胞特殊类型标记和肿瘤细胞凝结素结合特 性的研究。凝集素可以被多种标记物如荧光素、过氧化物酶、生 物素等所标记，进行免疫组织化学染色。
合物是先将HRP与生物素结合，然后按一定比例将此复合物与 卵白素反应，使每一个卵白素分子上结合3个带HRP的生物素， 留出一个能与其它生物素结合的空位。复合物上携带的HRP越多
，则酶催化的组织化学反应也越强烈，阳性结果也越明显
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种属特异性，可适用于任何种属的一抗。
当然，生物素结合的二抗必须是针对一抗种属的。因此，SABC法
较PAP法操作更简单、更灵敏。目前，SABC试剂盒已经商品化，
可以根据需要购买。
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（四）PAP法与ABC法联合（ABPAP）技术
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1．直接法 将标记物质直接标记在凝集素上，使其直接与切片
中的相应糖蛋白或糖脂结合。本法简便、快速，但灵敏度不高。
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将荧光、HRP或
胶体金标记的凝 集素直接用于未 处理组织，简单 迅速但敏感性差 。
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2．间接法 将生物素化的凝集素直接与切片中的相应糖 基结合，生物素同ABC复合物结合。本法简便、快速，而且灵敏度
免疫组化教程范文
免疫组化教程范文免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织切片中特定蛋白质、抗原或其他分子的方法。
通过IHC技术，可以在组织切片中观察到染色物质的分布和定位，从而研究蛋白质表达、分布和定位在正常生理和病理状态下的变化。
IHC的基本原理是将待检测的抗原与特异性抗体结合，然后通过染色剂标记该抗体，使得抗原可以在显微镜下被直接或间接观察到。
以下是IHC的基本步骤：1. 制备组织切片：从病理标本或实验动物中取得需要研究的组织，并用形alin固定和包埋成蜡块。
然后，用切片机切出厚度约为4-6微米的组织切片，然后将切片贴附到载玻片上。
2.抗原修复：组织切片在生理条件下（如溶液中）固定后，可能会导致抗原的结构和形态发生改变。
因此，需要进行抗原修复来恢复抗原的结构。
常用的抗原修复方法包括热敏抗原修复（如蒸汽加压或热水浴）和酶解抗原修复（如消化蛋白酶）。
3.阻断非特异性结合位点：组织切片中存在一些非特异性的结合位点，容易和标记抗体结合，导致假阳性结果。
因此，需要使用一种非特异性抗体（例如牛血清白蛋白）在切片上进行预处理，阻断非特异性结合位点。
4. 标记抗体：选择适当的抗体来结合待检测的抗原。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，且必须能够特异性地结合到待检测的抗原上。
此外，还需要选择一种染色剂将抗体标记，常用的染色剂有酶标记和荧光标记。
酶标记常用的包括辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP），而荧光标记则常用的有荧光素（FITC）、罗丹明（Rhodamine）等。
5.洗涤：在标记抗体过程中需要进行多次洗涤步骤，以去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质。
洗涤的目的是提高特异性和灵敏度。
6.反应-可视化：将标记抗体溶液加到组织切片上，使其与待检测的抗原结合。
如果使用酶标记抗体，则需要加入底物使其转化为可见的染色产物；如果使用荧光标记抗体，则直接在显微镜下观察荧光信号。
7.染色和显微镜观察：使用显微镜观察切片染色后的结果。
免疫组化技术
免疫组化技术免疫组化技术是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的重要技术手段。
它通过利用抗体与其特异性抗原相互作用的特性，实现对细胞、组织和分子的检测和定位。
本文将从免疫组化技术的原理、应用、优缺点等方面进行介绍。
首先，免疫组化技术的原理主要基于抗原与抗体的高度特异性反应。
抗原一般是指能够被免疫系统识别并引发抗体产生的物质，它可以是细胞膜上的蛋白质、细胞核中的核酸、胞浆中的酶等。
而抗体是机体免疫系统产生的一类蛋白质，具有高度特异性与抗原结合。
在免疫组化技术中，通常选择一种与目标物高度特异性结合的抗体，通过与目标物反应形成抗原-抗体复合物，再利用染色、荧光等方法对其进行检测和定位。
免疫组化技术广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
首先，在生物医学研究领域，免疫组化技术可以用于检测和定位特定蛋白质或细胞标志物。
例如，科研人员可以利用特异性抗体对肿瘤标志物进行检测，从而实现早期肿瘤的筛查和诊断。
此外，免疫组化技术还可以用于研究免疫反应、细胞分化和分子信号传递等生物学过程。
其次，在临床诊断中，免疫组化技术可用于肿瘤诊断、感染病的检测和诊断，以及免疫性疾病的诊断等。
临床医生可以利用免疫组化技术对病理切片进行染色，帮助判断疾病类型和严重程度。
免疫组化技术具有多种优点。
首先，它具有高度特异性和敏感性。
由于抗体与特定抗原的结合是高度特异性的，因此免疫组化技术可以实现对目标物的准确检测和定位。
其次，它可以同时对多个目标进行检测。
通过同时使用多个不同特异性的抗体，可以对多个目标分子进行检测，从而提高检测效率。
此外，免疫组化技术还可以实现对细胞或组织的形态学和功能的研究，有助于揭示生物学过程的机制。
然而，免疫组化技术也存在一些限制和不足之处。
首先，技术操作复杂。
免疫组化技术需要对抗体的选择、染色剂的选择和实验条件等进行严格控制，技术操作要求较高。
其次，需要合适的阳性和阴性对照。
在使用免疫组化技术时，需要合适的阳性和阴性对照样品，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化技术在疾病诊断中的应用
免疫组化技术在疾病诊断中的应用随着生物医学领域的飞速发展，疾病的检测和治疗手段也在不断更新换代。
免疫组化技术就是其中之一，它应用了分子生物学、免疫学等学科的核心理论和技术，为疾病诊断提供了强有力的技术支撑。
但是，相对于其他技术来说，免疫组化技术的应用范围和定位可谓是口耳相传，今天，我们就来了解下它的应用。
一、免疫组化技术的原理免疫组化技术是利用抗体与抗原的特异性结合性质，针对被检测物在细胞或组织中的位置和数量进行定位与计量的方法。
免疫组化技术在诊断发育异常，鉴别组织类型，评估分子分型等方面起着重要作用。
通常包括以下三个步骤：1.抗原修复：对组织标本进行脱水、透明化、石蜡包埋、切片处理后，需要将变性的蛋白质抗原复原，使其在免疫反应中保持原有的构象和活性。
2.抗体标记：采用特定的抗体，针对需要检测的抗原进行特异性识别。
通常会利用荧光素、酶等物质与抗体进行标记。
3.染色反应：通过化学反应使标记后的抗体与抗原发生特异性反应，然后利用化学染色方法将反应产物显示出来。
由于该方法产生直接的显色反应，可以直接在显微镜下观测到抗原的位置、数目和类型。
二、1.肿瘤标志物检测肿瘤标志物是特定癌细胞产生的分子，可以通过类似免疫组化的方法进行检测。
凭借其高度特异性的优势，与肿瘤相关的标志物已被广泛运用于临床诊断中。
例如，抗体检测可以用于检测肺癌、鼻咽癌和乳腺癌等常见癌症，可作为确诊和治疗指南的依据。
2.医学遗传学检测用于检测胚胎性基因突变的技术已经应用于不孕不育和男性生殖系统疾病的研究中。
广泛利用的检测技术包括比色法、荧光抗体法和原位杂交法等。
该技术可在多种组织类型中用于检测精子数、精子质量和卵子质量等遗传学特征。
3.炎症诊断炎症标志物可以识别并跟踪炎性疾病的病理过程，如红斑性狼疮和类风湿关节炎。
适当的抗体检测可为长期的追踪和监测提供经济而可靠的方法。
4.神经学和心理学研究镜片染色和FISH技术的应用可以为神经学和心理学研究提供直接的可视化反馈，使分子分型分析更加容易。
免疫组化技术实用篇教学课件
2023免疫组化技术实用篇教学课件pptcontents •免疫组化技术简介•免疫组化技术实验流程•免疫组化技术实验数据分析和解读•免疫组化技术实验优化和提升•免疫组化技术前沿进展和发展趋势目录01免疫组化技术简介免疫组化技术是一种用于研究生物组织中蛋白质表达和分布的生物学技术。
定义免疫组化技术分为直接法和间接法两大类，其中间接法应用最为广泛。
分类定义与分类直接法利用特异性抗体直接与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
间接法利用特异性抗体与组织切片中的目标抗原进行反应，形成抗原-抗体复合物，再用标记物进行显色，以检测抗原的存在。
免疫组化技术的原理1免疫组化技术的应用23免疫组化技术可用于疾病诊断，如癌症、自身免疫性疾病等。
疾病诊断免疫组化技术可用于科学研究，如在细胞和分子水平上研究生物大分子的相互作用和功能。
科学研究免疫组化技术可用于药物研发，如检测药物在组织中的分布和作用。
药物研发02免疫组化技术实验流程包括组织样本、抗体、抗原等；实验准备实验材料准备如显微镜、染色机等；实验仪器准备熟悉实验操作流程和注意事项。
实验操作准备切片制作将组织样本制作成切片，并进行脱蜡、水化等处理；加一抗将抗体稀释后加入切片中，孵育适宜时间；抗原修复使用抗原修复液对切片进行修复，以暴露出抗原；加二抗将标记有荧光素的二抗加入切片中，孵育适宜时间；阻断加入阻断液，以抑制内源性过氧化物酶活性；观察与拍照用荧光显微镜观察染色结果，并进行拍照记录。
实验步骤及操作流程实验注意事项实验前务必熟悉操作流程和注意事项；对于不同的组织类型和抗体，应根据具体情况调整实验条件和操作步骤；实验过程中要注意安全，避免受伤和感染；在实验过程中要保持实验室的清洁和整洁，遵守实验室规范。
03免疫组化技术实验数据分析和解读03定量PCR使用荧光定量PCR技术，检测样本中特定基因的表达水平，分析免疫组化染色的结果。
高级病理学：免疫组化技术原理与应用
乳腺良性肿瘤肌上皮完整， Actin＋ 乳腺癌浸润性，缺乏肌上皮， Actin－ 晚期乳腺癌，肌上皮萎缩或完全破坏消失
（三）神经源性肿瘤标记物
１、胶质纤维酸性蛋白（ Glial fibrillary acide protein ，GFAP）
Eng在1971年首先从人脑胶质细胞中分离出 来的一种酸性蛋白
①植物凝集素与糖 ②葡萄球菌A蛋白与IgG ③生物素Biotin与卵白素Avidin ④受体与配体 ⑤阴阳离子
ABC法(Avidin biotin-peroxidase complex)
染色原理与流程：
ABC：①Biotin+HRP Biotin-HRP
②1分子Avidin+3分子Biotin-HRP
２、与肿瘤生长相关的抗原 ①肿瘤胚胎抗原 ②肿瘤相关抗原 ③细胞机能抗原 ④某些酶与激素 ⑤病毒基因
其中，在肿瘤鉴别诊断中，具有代 表性的是５种中间丝蛋白：
①上皮细胞的角蛋白（Keratin） ②间胚叶细胞的波纹蛋白（Vimentin） ③肌细胞的结蛋白（Desmin） ④神经元的神经细丝
⑤神经胶质细胞的胶质细丝酸性蛋白
或4%胃蛋白酶消化30-60min，37°C 4，PBS 3X3min 5，0.3%H2O2甲醇液，室温10-30min 6，5%-10%正常血清，室温20 min 7，不洗，滴加适当浓度的特异性抗体，
如1：100的McAbDesmin，37°C60min，或4°C过夜 8，PBS 3X3min 9，生物素化羊抗鼠二抗，1：200，37°C，40min 10，PBS 3X3min 11，ABC1：100-1：150，37°C，40-50min
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(immunohistochemistry)
临床病理诊断中常用的抗体简介
人体组织细胞分类
• 上皮细胞：包括鳞状上皮，腺上皮，尿路上皮。 • 间叶组织：包括脂肪，肌肉，血管，纤维结缔组织，骨
和软骨组织，间皮。 • 神经组织：神经元，胶质细胞，神经纤维。 • 淋巴造血：淋巴细胞，粒细胞，浆细胞，单核细胞。 • 内分泌和神经内分泌组织：甲状腺，肾上腺，垂体，胰
性配对出现）
根据氨基酸序 列，将Keratin按 分子量和等电点 进行二维分类
CK抗体
广谱的细胞角蛋白 抗体
特殊的细胞角蛋白 抗体
常用的CK抗体
AE1/AE3:（CK pan）
最常用，胞浆呈细丝状阳性 正常上皮细胞阳性表达，肝细胞阴性。 在其他肿瘤，如小细胞癌，尿路上皮癌，室管膜瘤，胸
腺瘤，间皮瘤，上皮样肉瘤，上皮样血管内皮瘤，平滑 肌肉瘤，滑膜肉瘤等常呈阳性表达
CK19: 40KD的角蛋白，在单层上皮和间皮中表达，在
肝细胞不表达，用于鉴别肝细胞癌和胆管细胞癌；甲 状腺肿瘤中，甲状腺乳头状癌常阳性表达，良性和其 他癌很少表达。
CK14：50KD的角蛋白，在复层上皮表达，是鳞状上皮
的主要标记物。
间叶组织的标记物
– 波形蛋白（vimentin， VIM） – 肌组织标记物：Desmin（结蛋白）, actin（肌动蛋
等 • 浆细胞标记：CD38，CD138 • 其他：CD30,TDT,CD15，CD56，ALK，MUM1
神经组织标记物
• 胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein GFAP)
• S-lOO蛋白(S—100 Protein) • 神经元特异性烯醇酶 (Neuron Specific Enolase，
常用的CK抗体
CK5/CK6：
分子量为58KD和56KD的角蛋白，存在于鳞状上皮、导管 上皮的基底细胞、肌上皮细胞和间皮细胞，腺上皮不表 达
用于鳞癌和腺癌别，间皮瘤和腺癌的鉴别 导管上皮良恶性增生的鉴别
常用的CK抗体
34BE12（CKH）: 高分子量细胞角蛋白，前列腺基
底细胞标记，用于前列腺癌的诊断。
腺的内分泌腺，各器官的神经内分泌细胞等 • 其他：黑色素细胞，性腺
常用上皮性标记物
细胞角蛋白（cytokeratin,CK） 上皮膜抗原（epithelial membrane antigen, EMA） 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA） 其他：villin，Moc-31，MUC（粘蛋白）系列等
值。
常用的CK抗体
CK7和CK20： ➢ 分子量46KD，正常胃肠道，尿路上皮，Merkel细胞阳性表
达，肝细胞，乳腺，肺阴性表达 ➢ 主要用于胃肠道腺癌，卵巢粘液性癌，Merkel细胞癌的诊断 ➢ 鳞癌，甲状腺肿瘤，胸腺瘤阴性表达 ➢ 胆道和胰管的腺癌，小肠类癌，前列腺和间皮阳性表达 ➢ 与CK7和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价值。
淋巴造血组织，尤其淋巴细胞在其发育和分化过 程中能形成许多分化性抗原，应用这些分化性抗原的 特异性单克隆抗体能区分出免疫表型不同的细胞系， 而且还能区分出同一细胞系的不同亚型和不同分化阶 段的细胞群，因此可以利用此特性来诊断和分类恶性 淋巴瘤和白血病。
淋巴造血系统的标记
• 白细胞共同抗原（leucocyte common antigen,LCA,CD45）
NSE) • 髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)
神经内分泌系统标记物
NSE(Neuron Specific Enolase,神经元特异性烯醇酶) CgA(chromogranin A 嗜铬颗粒蛋白A) Syn(synaptophysin 突触囊泡蛋白) CD56
Cytokeratin（keratin或CK）
• 上皮细胞的骨架形成蛋白（中间丝）， 维持上皮细胞的结构和功能
• 分为I型和II型(酸性和碱性或中性）， 编码基因分别位于17q21.2和 12q13.13，共54个基因
• 表达方式与组织类型和细胞分化程度有 关，具有高度的特异性
• 蛋白具有不同的分子量和等电点 • 细胞中keratin常成对出现（酸性和碱
白）, myogenin（肌浆蛋白），MyoD1（肌调节蛋白 ）等 – 脉管标记：血管内内皮细胞的标记物：CD34,CD31, 淋巴管D2-40 – 组织细胞的标记物：CD68, CD163,等 – 间皮细胞的标记物：calretinin，mesothelial等 – 用于鉴别软组织肿瘤的来源
淋巴造血系统的标记
• 免疫球蛋白(immunoglobulin Ig) • 全B细胞标记物:CD20, CD79a, PAX5, Bob1等 • 全T细胞标记物：CD3, CD43, CD5, CD7,CD2等 • T淋巴细胞亚群标记物：CD4,CD8 • 粒细胞和单核—巨噬细胞相关标记物:MPO, CD34,CD68
器官或组织特异性抗原标记物
前列腺标记物： PSA， PSAP，PSMA，P504s 甲状腺标记物：TG，CT，TTF-1 甲状旁腺：PTH 黑色素细胞标记物：MB45，S100，MelanA 肺腺癌的标记物：TTF-1，SP-A和B， Napsin A 肝细胞癌标记物：Hep-1 乳腺： Mammaglobio，GCDFP15 结肠： CDX2，B-catenin 宫颈癌：P16
病原体的标记
• EBV • HPV • HBsAg 和HBCAg • MCV
与肿瘤预后相关的标记物
Ki67：核阳性，与肿瘤增殖相关，细胞周期中除G0期细 胞外，其余细胞均表达。肿瘤阳CK7和CK20： ➢ 分子量为54KD,正常乳腺，肺，尿路上皮阳性表达，胃
肠道，肝细胞，前列腺阴性表达 ➢ 主要用于乳腺癌，肺腺癌与胃肠道癌的诊断与鉴别诊断 ➢ 胰腺癌，胆管癌，卵巢和子宫内膜腺癌，尿路上皮癌阳
性表达。卵巢粘液性癌，前列腺癌，肝癌阴性表达 ➢ 与CK20和其他抗体合用对判断腺癌的来源具有重要价