试验酶活测定方法

1淀粉酶活性测定

原理

淀粉酶从淀粉中分解出还原物质，可以从他们与3，5—二硝基水杨酸的还原反应能力来测定这些还原物质，以一水麦芽糖计算。一个淀粉酶单位相当于在规定条件下释放lmg还原碳水化合物(以一水麦芽糖计算)时所需的酶量。

主要试剂

(1)磷酸盐缓冲液(PH 6.9)；取0.067M的磷酸二氢钾溶液(9.12gKH2PO4溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)与0.067M的二水磷酸氢二钠溶液 (11.93gNa2HPO4·2H20溶于蒸馏水中，并定容至1000m1)混合，直至用测得其PH值达到6.9为止。取39mg氯化钠溶于35ml上述溶液内，并用蒸馏水定容至lOOml。

(2)底物溶液：取1.Og可溶性淀粉溶于lOOml上述磷酸盐缓冲液。

(3)指示剂溶液：取1.Og 3,5-二硝基水杨酸(C7H4N207)与少许蒸馏水拌和。添加20ml2N氢氧化钠溶液后此酸便溶解。取30.0g四水酒石酸钾钠(C4H4KNaO6·4H2O)溶于此溶液，并用蒸馏水将此指示剂定容至100ml。

(4)麦芽糖溶液；称取lOOmg一水麦芽糖(C12H22O11·H20)用蒸馏水定容至lOOml。

测定方法

用移液管将1.Oml底物溶液移入一试管，并加热至25℃。加1.Oml酶溶液(同样也已预热至25℃)，摇匀，保温3min后加2ml指示剂溶液，终止反应。将此溶液置于沸水浴中5min后，取出来置于冰水中或进行流水冷却。随后用蒸馏水定容至20ml。用分光光度计于490nm处，以空白值为参比测定其颜色深度。以1ml灭活的酶液作为空白对照。

2脂肪酶活性测定

原理

脂肪酶为一种水解酶，在一定条件下，可以把甘油三酯脂肪逐步水解，最后生成甘油及对应的脂肪酸。用己知浓度的标准溶液对水解液进行滴定，即可定量求出脂肪酸的量，从而求出脂肪酶活性。

1个脂肪酶单位相当于在试验条件下释放出1μmol醋酸所需的量。

主要试剂

(1)0.025 mol·L-1磷酸缓冲液(PH 7.5)：

甲液：称取KH2PO417．Olg，加水定容到500ml。

<2>乙液：称取Na2HPO4·12H2O 44.7g，加水定容到500ml。

<3>取甲液13ml，乙液lOOml混合，即成PH 7.5、0.25 mol·L-1磷酸缓冲液，再稀释10倍即成PH 7.5、0.025 mol·L-1磷酸缓冲液。

(2)聚乙烯醇橄榄油乳化液：

4％聚乙烯醇液：称取40g聚乙烯醇(聚合度为1000～1750)，加蒸馏水约1000ml，水浴加热搅拌至溶。冷却后定容至1000ml，双层纱布过滤，备用。

<2>最终乳化液：取上述4％聚乙烯醇溶液150ml，加50ml橄榄油，于高速组织捣碎机中搅动6分钟(分两次进行)，即成乳白色聚乙烯醇橄榄油乳化液。

(3)0.05 mol·L-1氢氧化钠标准溶液：称取40g氢氧化钠加蒸馏水至1000ml，成为约1N的溶液，经标定浓度后准确稀释到0．05N。

(4)1％酚酞指示剂：lg酚酞溶于100m195％乙醇中。

测定方法

加5ml 0．025 mol·L-1(PH 7．5)磷酸缓冲液和4ml聚乙烯醇橄榄油乳化液于三角烧瓶中，置于40℃水浴中预热lOmin。加入酶液lml，40℃保温15min，立即加入15ml 95％的乙醇终止酶的反应。加酚酞指示剂2—3滴后以0.05 mol·L-1氢氧化钠标准溶液滴定到微红色，记下氢氧化钠溶液的消耗体积。

重复二次测定。并以lml灭活酶液代替作为空白对照。

3蛋白酶活性测定

原理

磷钨酸和磷钼酸的混合物(即福林酚试剂)在碱性溶液中极不稳定，易被酚类化合物还原为蓝色化合物(钼蓝和钨蓝混合物)。用蛋白酶催化水解血红蛋白(底物)游离出含酚基的氨基酸，与福林酚试剂呈蓝色反应，可从蓝色的深浅测定酶活性的大小。

在37℃,每分钟胃蛋白酶A分解血红蛋白产生的溶于三氯乙酸的物质，与福林酚试剂反应后在660nm的光吸收值相当于lμg分子酪氨酸所给出的光吸收值则为1个单位。

主要试剂

(1)底物溶液(2％血红蛋白)：lg血红蛋白溶于50ml 0.06N盐酸。

(2)1N福林酚试剂。

(3)0.5N氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠4g，用蒸馏水定容至200ml。

(4)5％三氯乙酸： 5g三氯乙酸溶于100ml蒸馏水。

(5)0.0lN盐酸：取盐酸0.84 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。

(6)0.06N盐酸：取盐酸5.04 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。

(7)0．2N盐酸：取盐酸16.8 ml，用蒸馏水定容至1000 ml。

(8)酪氨酸标准液：精密称耿干燥到恒重的酪氨酸0.01812 g，用0，2N盐酸溶解并稀释到100ml，此溶液每ml含酪氨酸1μg分子。

测定方法

在25℃恒温条件下，取3支试管按表8进行测定。

表8蛋白酶活性测定