HTRF技术原理和应用介绍
htrf法 -回复
htrf法-回复[HTRF法]：一种高灵敏、高准确性的生物分析技术引言：近年来，生物分析技术在生命科学和药物研发领域发挥着至关重要的作用。
其中，HTRF法（Homogeneous Time-Resolved Fluorescence Assay）以其高灵敏度、高准确性和简便操作而备受瞩目。
本文将一步一步回答关于HTRF法的基本原理、应用领域和未来发展方向。
一. HTRF法的基本原理HTRF法是一种光学测量技术，其基本原理是通过荧光共振能量传递来检测分子之间的相互作用或反应。
这个传递过程需要三个关键成分：Donor 标记物、受体标记物和荧光基质。
1. Donor标记物：Donor标记物是受体分子表面的产生能量的物质，通常是用稀土金属离子（如铕或镭）标记。
Donor标记物在受到激发光照射后会发射光子。
2. 受体标记物：受体标记物是Donor标记物能量传递的接收者，通常用荧光染料或荧光蛋白标记。
当Donor标记物的发射光与受体标记物的激发光在频率匹配时，能量会传递给受体标记物。
3. 荧光基质：荧光基质是一个短寿命的荧光化合物，例如有机化学家染料Terbium。
荧光基质在受到发射光照射后，会产生荧光信号，并在一段时间后减弱。
基于这个原理，HTRF法如下工作原理：首先，通过标记Donor和受体标记物，将其加入试验样品中。
当样品中发生特定的分子相互作用或反应时，Donor标记物的发光会与受体标记物的激发光匹配，从而传递能量，使受体标记物产生荧光。
荧光基质会吸收这些荧光，并在一段时间后发射出荧光信号，该荧光信号可以被检测并与样品中分子相互作用的程度相关联。
通过检测荧光信号的幅度与光谱特性，我们可以量化目标分子相互作用的强度和动力学参数。
二. HTRF法的应用领域1. 蛋白质相互作用研究：HTRF法被广泛应用于研究蛋白质相互作用，如配体-受体结合、酶底物结合等。
该技术不仅能够定量测量蛋白质相互作用的强度，还可以研究这些相互作用的动力学参数。
均相时间分辨荧光技术
卡尔·古斯塔法·莫桑德尔 （Carl·Gustaf·Mosander）
背景简介——镧
镧的发现
镧于1839年1月，由在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡研究所的卡尔·古斯 塔法·莫桑德尔（Carl·Gustaf·Mosander）发现。他从在1803已 经发现的铈中提取了它。莫桑德尔注意到他的大多数氧化铈样本不 可溶，而有些是可溶的，他推断这是一种新元素的氧化物。他从铈 中提取出了第二种元素，他称之为didymium（镨钕混合物）。然而 他没有意识到didymium也是混合物，在1885年它被分离成了镨和钕。
利用长发射半衰期的稀土镧系元素作为供体荧光团，HTRF技术结合了荧光共振能量转移 （FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence） 两种技术。这种结合将TRF 的低背景特点和FRET 的均相实验方式融合在一起，使得 HTRF 技术拥有 如下优势：实验方式灵活、可靠，并且具有更高的灵敏度、 稳定，实验结果的假阳性率较低
镧系元素：lanthanide element
镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土元素的第二道大门， 是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继铈和钇两个元素后又 找到稀土元素中的三个。镧以及接着发现的铒、铽打开了发现稀土 元素的第二道大门，是发现稀土元素的第二阶段。他们的发现是继 铈和钇两个元素后又找到稀土元素中的三个。
二、荧光共振能量转移
荧光共振能量的缺点：
然而，这些生物测定法在荧光检测方面具有很大的缺点，因为它被来自散射激发光的背 景噪声显着抑制，并且受到样品中共存材料荧光（荧光化合物和粉尘/线）的显着干扰，使其 变得困难以获得高度敏感的测量而且在 FRET 实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰 期非常短，其背景荧光较强。
htrf法 -回复
htrf法-回复[htrf法]原理与应用领域[htrf法]（High-throughput Fluorescence Resonance Energy Transfer）是一种高通量荧光共振能量转移技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将逐步讨论[htrf法]的原理、实验步骤和应用领域。
一、[htrf法]原理[htrf法]利用荧光分子之间的共振能量转移现象，测量分子之间的相互作用。
当两种荧光染料分别存在于分子A和分子B上时，它们的光谱特性可以相互影响。
其中一种染料吸收光子的能量会以非辐射跃迁的方式传递给另一种染料，从而导致获能染料的发射峰增强，另一种染料的发射峰减弱。
这种共振能量转移现象可以通过检测发射光谱的变化来量化分子之间的相互作用。
二、[htrf法]实验步骤1. 实验准备：准备待测样本、荧光探针和仪器设备。
2. 样本标记：将待测的分子A和分子B各自用不同的荧光染料标记。
选择合适的染料对是非常重要的，需要考虑其发射和吸收波长的兼容性以及染料的光稳定性。
3. 混合反应：将标记的分子A和分子B混合，使它们相互作用。
也可以加入其他试剂以改变反应条件，以便研究分子间的互作用。
4. 测量反应结果：使用[htrf法]分析仪器测量样品的荧光发射谱。
该仪器可以同时测量两种不同波长的荧光发射。
5. 数据分析：根据[htrf法]原理中共振能量转移的特点，分析测量到的发射谱数据，计算共振能量转移的效率。
这可以通过计算荧光峰的比例来完成，即获能染料峰的强度与失能染料峰的强度之比。
三、[htrf法]应用领域[htrf法]在生物医学研究中具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 蛋白质相互作用研究：[htrf法]可用于研究蛋白质之间的相互作用，如蛋白质与配体的结合和酶促反应。
通过标记不同的蛋白质和配体，可以研究它们之间的相互作用及其动力学特性。
2. 细胞信号转导：[htrf法]可以用于研究细胞中信号传递途径的动态过程。
高通量药物筛选
放射性分析技术，主要应用于检测RNA
转录，测定P56激酶活性，对氨基乙酰化 tRNAd进行测定以及肝炎C病毒NS3蛋白 酶抑制剂的药物筛选等方面。
比色技术，用于检测具有吸收性质的物
质浓度，根据光线经过被检物质后被吸收 的多少，来评价吸收物质的含量。是目前 应用最广泛的一向检测法。
发光检测技术，有些生物和化学物质可以在
高通量药物筛选的出现，使药物筛选逐步实现 规模化、自动化和集成化，具有筛选速度快，所 需样品用量少的特点。
传统药物筛选
高通量药物筛选
人类疾病相关动物模型
药物作用分子靶点
↓
药物筛选发现有效药物
↓
药物筛选
↓
活性化合物
↓
活性化合物
↓
药效学研究
↓
作用机制研究
↓
组织器官水平研究
↓
组织、器官水平研究
↓
作用机制研究
↓
带筛样品的准备
↓
筛选的实施
↓
数据分析
药物发现的基本过程
初筛和复筛（分子、细胞水平） 深入筛选（综合分析获得先导化合物） 确证筛选（确定开发前景并进行临床研究）
高通量药物筛选的前景
• 高通量药物筛选只经过十余年的实践检验， 在药理发现理论研究、技术方法的研究及 筛选结果评价的研究方面，任需要完善。 而如何提高高通量药物筛选的效率和准确 性，是目前亟需解决的重要问题。
➢ 荧光强度分析法
原理：许多分子带有天然荧光基团，当待测 大分子本身的荧光团不够强烈而无法检测 时，可结合一些荧光染料以加强其光谱特 征，然后根据其荧光强度的变化进行检测。
➢时间分辨荧光分析
原理：利用激发波长、发射波长和荧光寿 命的变化，对物质进行检测。 该方法具有灵敏度高、无放射性危害、标 记物稳定、线性范围宽、分析速度快和操 作简便等优点，受到广大药物筛选工作者 的关注。
HTRF生物过程和抗体药物研发解决方案
HTRF生物过程和抗体药物研发解决方案前言随着现代生物技术的迅猛发展，运用功能基因组学、蛋白质组学、生物信息学等现代生化与分子生物学技术，结合基因工程、蛋白质工程、细胞工程等技术，使得生物技术药物研发高潮迭起。
当前，治疗性抗体药物研发已成为生物技术药物领域的热点。
治疗性抗体也称为抗体药物，指能在体内发挥疾病治疗作用的抗体制剂。
200年前，人们将自白喉杆菌培养上清液中分离到的可溶性毒素注入马体内，发现得到的抗血清可以治疗白喉，这是第一个用抗体治疗疾病的例子。
20世纪70年代德国学者Geroge KÖhler和英国学者Cesar Milstein利用细胞融合技术成功地制备了杂交瘤单克隆抗体 (mAb)以来，抗体的生产技术才实现革命性的突破, 其在诊断、治疗、预防和蛋白提纯方面显示了重要的作用和非常广阔的应用前景。
进入80年代，随着免疫学和分子生物学技术的发展，以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始被用于抗体的改造，人们可以根据需要对以往的鼠抗体进行相应的改造，以消除抗体应用的不利性状或增加新的生物学功能，还可用新的技术重新制备出各种形式的重组抗体，标志着基因工程抗体时代的来临。
自第一个基因工程抗体——人-鼠嵌合抗体于1984年诞生以来，新型基因工程抗体不断出现，包括嵌合抗体，人源化抗体、小分子抗体（Fab片段、单链抗体、单域抗体等）、多价小分子抗体（双链抗体等）及抗体融合蛋白（免疫毒素、同位素等）等不断完善，目前全人抗体生产技术也已处于蓬勃发展中。
最近的统计显示，在基于生物技术背景而进行临床实验的药物研究中，单克隆抗体药物占据了18%，治疗性单克隆抗体已发展成为非常具有市场应用价值的产品。
2009年FDA批准的14个药物中有4个为全人抗体，而这4个抗体药物中有两个抗体来自强生公司，使强生公司称为2009年抗体药物的最大赢家。
目前，美国已批准26个单抗药物用于治疗，主要包括癌症，慢性炎症，移植，感染疾病和心血管疾病。
htrf方法学
htrf方法学一、HTRF方法学简介高灵敏度时间分辨荧光（HTRF）方法学是一种生物分析技术，主要用于检测低浓度目标分子。
它结合了时间分辨荧光（TRF）技术和高效液相色谱（HPLC）技术，具有高灵敏度、高特异性和宽线性动态范围等特点。
二、HTRF技术原理HTRF技术通过将目标分子与荧光标记物结合，利用荧光信号的强度和时间特性进行分析。
在实验过程中，样品经过HPLC分离，随后通过荧光检测器检测，实现对目标分子的定量分析。
三、HTRF方法学的应用领域HTRF方法学广泛应用于生物科学研究、药物筛选、生物标志物检测等领域。
在生物科学研究中，HTRF技术可用于研究蛋白质相互作用、酶动力学、核酸杂交等；在药物筛选中，可用于筛选药物靶点、评估药物活性等；在生物标志物检测中，可用于疾病诊断、疗效监测等。
四、HTRF方法学的优势与局限性优势：1.高灵敏度：HTRF技术可检测低至ng/L级别的目标分子。
2.高特异性：可通过特异性抗体或核酸探针实现对目标分子的识别。
3.宽线性动态范围：适用于不同浓度范围的样品分析。
4.快速检测：实验流程简便，检测速度较快。
局限性：1.仪器设备较高：HTRF仪器设备相对昂贵，投入成本较高。
2.检测范围有限：对于高浓度样品，HTRF方法的检测效果较好，而对于高分子量或大分子复合物的分析能力较弱。
3.操作技巧要求较高：实验过程中需要严格控制条件，以避免非特异性信号干扰。
五、我国HTRF研究与发展现状近年来，我国HTRF技术研究取得了显著成果，不仅在基础研究方面取得了突破，还成功应用于临床医学、药物研发等领域。
此外，国内多家企业致力于HTRF仪器设备的研发与生产，逐步降低了国外产品的市场占有率。
六、未来发展趋势与展望随着科学技术的不断发展，HTRF方法学在以下几个方面有望取得突破：1.仪器设备的微型化和便携化：通过技术创新，降低设备成本，实现HTRF 仪器的便携化，以满足现场快速检测的需求。
HTRF技术原理和应用介绍
Cisbio-HTRF®技术原理和应用简介HTRF®均相时间分辨荧光;Homogeneous Time-Resolved Fluorescence 是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术..该技术基于荧光共振能量转移FRET;Fluorescence Resonance Energy Transfer 和时间分辨荧光TRF; Time-Resolved Fluorescence两大技术;开通的一款高通量药物筛选利器..荧光共振能量转移FRET利用两种荧光基团的能量转移;这两种荧光基团分别称为能量供体Donor和能量受体Acceptor..Donor被外来光源激发例如氙灯或激光;如果它与Acceptor比较接近;可以将能量共振转移到在Acceptor上;使其受到激发;发出特定波长的发射光..将Donor和Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合;生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离;产生能量转移;由于Acceptor的发射光来自能量转移;所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开;即不需要洗涤步骤..时间分辨荧光TRFTRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质;它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同..普通荧光的半衰期为纳秒级..镧系元素的半衰期为毫秒级;有6个数量级的差别..所以;在检测室;TRF有一个时间延迟---50us;经过这个时间延迟;普通荧光的信号几乎为零;所以;TRF的背景非常低;反映样品实际情况..HTRF®的能量受体技术创新点HTRF®的能量供体是铕Eu和钛Tb的穴状化合物..在这个穴状化合物里;Eu和Tb被永久地嵌合在一个笼子里;结构非常稳定;这个结构由J.M.Lehn’s教授发明的;并由此在1987年获得了诺贝尔奖..HTRF®的能量受体HTRF®的能量受体也有二种;XL665和d2.它们的光学性质相同;分子量不同;前者分子量为10KD;实际上就是别藻蓝蛋白APC..我们将APC的亚基偶联在一起;使其不能解离;提高了稳定性;后者分子量为1KD;在某些实验中有独特的优势..HTRF®的操作步骤HTRF®操作步骤非常简单;只需要将实验所需试剂加进去;然后孵育;检测即可..HTRF®实验数据分析HTRF®采用了比值法来处理数据;可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差..HTRF®应用范围G蛋白偶联受体研究激酶活性检测生物标志物检测受体第二信使检测受体配体结合胞内信号分子检测胞外激酶活性检测胞内激酶活性检测基于抗体的夹心法和竞争法检测抗体检测生物/免疫过程分析免疫检查点检测抗体重链含量检测抗体轻链含量测定GST含量测定CD16结合检测HIS含量测定CD32结合检测CHO宿主蛋白含量测定CD64结合检测PD1/PD-L1 CTLA4/B7-1LAG3/MHC II CD47 / SIRP alphaCTLA4/B7-2 Adenosin A2A相互作用分析蛋白修饰实验室服务蛋白-蛋白/ 蛋白-多肽蛋白-DNA / 蛋白-RNA 蛋白甲基化/ 蛋白乙酰化蛋白泛素化/ 蛋白水解univlabuniv-bioHTRF®技术优势：1.操作简单;空板直接加样;加完即可检测;时间短加样和孵育2h2.适合珍贵样本：整个实验体系只需20ul3.均相检测：无需包被;免洗ELISA;省时省力4.体系稳定：7天内可随时检测;信号基本不变5.数据客观真实：比值处理可有效去除背景荧光;假阳性率和价阴性率低6.高端检测;只需简单的酶标仪就可以轻松搞定HTRF®检测的仪器Cisbio与几乎所有的仪器供应商都建立了合作伙伴关系;下面是经过验证的仪器列表:。
均相时间分辨荧光
Bagnols-sur-Cèze法国-2009年11月5日-Cisbio Bioassays ()公司是IBA旗下的子公司，也是药物研究和药物筛选领域HTRF (均相时间分辨荧光)技术的发明者。
今天Cisbio公司宣布，其在中国和韩国已建立了自己的销售团队，以便进一步开发亚洲市场。
本土销售团队将能让Cisbio为这两个迅速增长的生物制药市场的客户提供GPCR和激酶研究的HTRF平台、生物标志物检测以及其他相关的服务。
Cisbio Bioassays公司所销售的基于HTRF技术的产品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk 以及Tag-lite™细胞表面受体平台。
这些业务将会通过IBA集团旗下的IBA中国分公司()来操作。
为了在亚洲市场拓展应用于癌症诊断和治疗方面的放射药物产品、仪器和方法, IBA集团于2007年建立了IBA中国公司。
韩国的销售业务则由位于首尔的代理商JCBio公司(www.jcbio.co.kr)负责。
JCBio公司专注于为制药和生物技术实验室提供相关商品。
“在过去的10年里，我们一直致力于在欧洲、北美和亚洲建立本土化的团队，针对特定市场并拓展我们在当地的业务。
” Cisbio Bioassays 市场部主管François Degorce说道，“我们的目标是成为一个客户至上的服务性公司，并让业务遍及全球。
我们在中国和韩国的团队将帮助我们促进与该两个重要市场的客户的关系。
”作为2009年度 Frost & Sullivan北美技术创新奖项的获得者，Cisbio Bioassays凭借着其专利技术HTRF领先于均相荧光方法领域。
HTRF是一种很灵敏且稳定的技术，主要应用于药物研发的高通量筛选阶段。
除了基于HTRF的一些产品外，Cisbio还能提供一系列的定制服务，其包括：为客户特定的实验蛋白，抗体或化合物等进行标记，为客户设计和研发实验方法，以及为客户提供HTRF 技术培训。
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Cisbio-HTRF®技术原理和应用简介
HTRF®（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。
该技术基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两大技术，开通的一款高通量药物筛选利器。
荧光共振能量转移（FRET）
利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。
Donor被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。
将Donor和Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。
时间分辨荧光（TRF）
TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质，它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。
普通荧光的半衰期为纳秒级。
镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。
所以，在检测室，TRF有一个时间延迟---50us，经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零，所以，TRF 的背景非常低，反映样品实际情况。
HTRF®的能量受体（技术创新点）
HTRF®的能量供体是铕(Eu)和钛(Tb)的穴状化合物。
在这个穴状化合物里，Eu和Tb被永久地嵌
合在一个笼子里，结构非常稳定，这个结构由J.M.Lehn’s教授发明的，并由此在1987年获得了诺贝尔奖。
HTRF®的能量受体
HTRF®的能量受体也有二种，XL665和d2.它们的光学性质相同，分子量不同，前者分子量为10KD，实际上就是别藻蓝蛋白（APC）。
我们将APC的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性，后者分子量为1KD，在某些实验中有独特的优势。
HTRF®的操作步骤
HTRF®操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育，检测即可。
HTRF®实验数据分析
HTRF®采用了比值法来处理数据，可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。
HTRF®应用范围
Cisbio与几乎所有的仪器供应商都建立了合作伙伴关系，下面是经过验证的仪器列表:。