蛋白相互作用研究法

细胞水平的蛋白质相互作用研究方法

【摘要】本文介绍了蛋白质研究中常用的在细胞水平研究蛋白质相互作用的方法，即酵母双杂交系统、荧光共振能量转移技术、蛋白质片段互补技术、双分子荧光互补技术、绿色荧光蛋白临近成像法等等。并比较了各自的优缺点以及应用范围。

【关键词】蛋白质相互作用酵母双杂交荧光共振能量转移片段互补双分子荧光互补绿色荧光蛋白临近成像

蛋白质是生物体中绝大多数生命活动的基本执行单位，参与细胞中几乎所有的生化过程；而细胞内复杂的生化反应网络的运行离不开不同蛋白质之间的相互作用。蛋白质相互作用在蛋白质功能复合体的构建、细胞信号转导、物质跨膜运输、酶促修饰等过程中是必不可少的，因而研究细胞生命活动的完成离不开对相关蛋白质间相互作用的研究。相关研究方法很多，但能在细胞水平上展示蛋白质相互作用的存在是最为直接而有说服力的方法。目前，细胞水平的研究方法主要有以下几种：

1酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H)

酵母中的Gal4转录调控因子由N端DNA结合域(binding domain, BD)和C端转录激活域(activating domain, AD)构成，完整的Gal4因子能有效激活下游基因的表达。将诱饵蛋白(bait)和靶蛋白(target/prey)基因分别与BD、AD基因融合，并在酵母中表达，如果表达的诱饵蛋白与靶蛋白之间相互作用使得BD、AD结构与空间上相互靠近，就会激发完整的Gal4活性引发报告基因的表达，检测报告基因产物即可知被研究蛋白间是否有相互作用。

酵母双杂交系统的限制在于只能研究核蛋白的相互作用，并且融合蛋白在酵母细胞中并不一定具有天然活性，易产生假阳性和假阴性，但是作为一种能够进行大规模筛选的方法仍有优势。由此衍生的方法有细菌双杂交系统和哺乳动物双杂交系统等。

2荧光共振能量转移技术(fluorescence resonance energy transfer, FRET)

当两个荧光基团在空间上充分靠近(1–10nm)时，适当波长的光波会引发供体基团与受体基团产生共振，供体基团所吸收的能量通过共振向受体基团转移，受体基团受激发产生荧光。应用基因操作手段可以将蓝色荧光蛋白(CFP, 供体)和黄色荧光蛋白(YFP, 受体)分别与待研究的蛋白融合并在细胞中原位表达，通过检测光激发下细胞发出的光波波长即可判断是否发生了共振能量转移，即两蛋白是否有相互作用。

FRET的效果易受外源荧光导致的光漂白和背景噪音影响，在此基础上发展了化学发光共振能量转移技术，该技术用荧光酶的自发荧光代替FRET中的外源荧光，当蛋白质相互作用导致空间上的靠近时，由供体荧光酶向受体荧光蛋白进行能量转移，通过测量供体自身发光强度与受体发光强度之比得出相互作用强弱，避免了以上影响。共振能量转移技术具有高灵敏度和实时监测、对相互作用进行定位等优点。缺点是成本较高。

3蛋白质片段互补技术(protein complementation assay, PCA)

蛋白质功能的实现依赖于结构的完整性，完整蛋白的两个互补片段不能单独发挥作用，但若在空间上距离足够近就可以恢复原有功能。PCA技术将功能蛋白分割为适当的两部分分别与目标蛋白融合，当目标蛋白在细胞中靠近相互作用时，被分割的蛋白片段互补恢复活性，通过检测活性即可判断目标蛋白是否发生相互作用。

用于PCA的功能蛋白有二氢叶酸还原酶、β-半乳糖苷酶、β-内酰胺酶、荧光素酶和荧光蛋白等等。相比较于需要通过底物检测酶活性的各种酶来说，荧光蛋白因其不需底物反应直接观察荧光而具有优势，被称为双分子荧光互补技术(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)。当功能蛋白为酶时，通过检测底物反应活性只能判断目标蛋白是否有相互作用，但BiFC结合显微技术可以对蛋白相互作用进行细胞内的定位，真正发挥了作为细胞水平研究方法的优点。BiFC的缺点在于分割后的荧光蛋白片段在相遇重组时需要一定自催化时间，不能做到实时监测。

4绿色荧光蛋白临近成像法(GFP proximity imaging, GFP-PRIM)

由于有供体受体或N端C端的不同，FRET和PCA等方法不能用于研究同种蛋白形成的同源多聚体。GFP-PRIM技术基于绿色荧光蛋白在395nm和475nm处各有一个激发峰，而聚集形态的不同会导致GFP在两激发峰处的激发效率之比发生变化。将GFP与目标蛋白相融合，若目标蛋白发生聚集使得GFP空间上临近，就可以通过检测上述比值得到证明，这为研究同种蛋白的聚集和相互作用提供了方法。

其它研究蛋白质相互作用的方法包括免疫共沉淀(Co-IP)、亲和色谱、GST-pull down技术、质谱技术(MS)、表面胞质团共振技术(SPR)、噬菌体展示、串联亲和纯化(TAP)以及生物信息学手段等等。相比较于这些技术，以上介绍的细胞水平研究方法在更大程度上提供了在体的环境，使得观察到的蛋白质相互作用关系与实际生化过程更为接近，并可在亚细胞水平对相互作用进行定位，更具说服力，当然也受到更多因素影响。普遍的问题是融合蛋白与原目标蛋白的生化特性可能不同，影响正常的相互作用产生假阳性和假阴性，另外荧光技术的使用对空间距离要求较高，若融合不当，可能检测不出荧光，以及高通量技术的开发等等。在现有完整细胞观察的基础上进一步减小展示方法对目标作用过程的影响，是目前蛋白质相互作用研究的一个方向。

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