定性实验方法学验证
定性试验评价和检测结果一致性检验的统计分析方法Jerry
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CLSI EP文件介绍
定性测定的性能分析（CLSI EP12-A2） 检测结果一致性检验的统计分析方法
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CLSI EP文件介绍
定性测定的性能分析（CLSI EP12-A2）
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定性测定的性能验证（CLSI EP12-A2）
1、定性试验评价指标
特异性； 灵敏度； 测定下限； 重复性； 准确性； 抗干扰能力。
同样一份样本，在多次重复实验中各有50%的几率获得阳性或阴性的结果时该 分析物的浓度。 临界点与试剂盒阳性反应判断值（Cutoff值）的区别
a) 这里的临界点指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓度，其一旦确定， 是不变的；
b) 试剂盒Cutoff值指的是一个判断某一次测定结果的由阴性和阳性对照信号值 按一定公式计算出来的信号值，每次测定都会有所差异。
临界点的(精密度）重复性指的是什么？ 是为正在评价的检测试剂或系统建立分析物的临界浓度(C50)，并且确保临界
浓度±20%的Leabharlann 围处于95%区间内(C5~C95)。
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定性测定的性能验证（CLSI EP12-A2）
3、Cutoff重复性和测定下限验证 临界值（Cutoff）：实验结果处于（阴、阳性）分界点时的样品中分析物浓度
两种不同方法的不精密度曲线比较
比对试剂的C50和C5~C95区间能反映试剂的灵敏度和不精密度。试剂 批内与批间C50的差异越小，说明试剂的重复性越好。C50浓度也反映出 试剂灵敏度的差异，C50浓度小的试剂对低浓度的标本检出能力强，检测 灵敏度较高。在同C50下C5~C95范围越小，说明试剂的精密性越好。
超出这种方法的95%区间？
40次测定的阳性结果 ≤ 13 40 (32.5%) ≥ 27 40 (67.5%)
家兔糖定性实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 了解家兔肾脏对葡萄糖的重吸收功能。
2. 掌握糖定性实验的操作方法及原理。
3. 分析实验结果，验证肾小管对葡萄糖的重吸收作用。
二、实验原理人体内葡萄糖通过肾小球滤过，但大部分葡萄糖在肾小管中被重吸收。
本实验通过静脉注射葡萄糖，观察尿液的变化，来判断肾小管对葡萄糖的重吸收功能。
实验原理如下：1. 正常情况下，尿液中的葡萄糖含量极低，糖定性实验结果为阴性。
2. 当静脉注射葡萄糖后，血液中的葡萄糖浓度升高，超过肾糖阈（约180mg/dL），肾小管无法将所有葡萄糖重吸收，导致尿液中的葡萄糖含量增加。
3. 葡萄糖含有醛基，具有还原性。
将尿液加热煮沸后，葡萄糖会将班氏试剂中的硫酸铜还原为氧化亚铜，使试剂由蓝色变为砖红色。
三、实验材料1. 实验动物：家兔2. 实验器材：注射器、酒精棉球、手术刀、手术剪、镊子、试管、班氏试剂、蒸馏水、葡萄糖溶液、试管架、酒精灯、加热器3. 实验试剂：班氏试剂、葡萄糖溶液、蒸馏水四、实验步骤1. 家兔处死：使用注射器抽取10ml空气，迅速注入家兔耳缘静脉。
观察家兔反应，确认其已死亡。
2. 解剖家兔：打开家兔腹腔，暴露肾脏。
剪开肾包膜，取出肾脏。
3. 肾脏处理：将肾脏放入生理盐水中洗净，去除血污。
将肾脏置于解剖盘上，用手术刀和镊子将肾小球、肾小管等组织分离。
4. 肾小管收集：将肾小管放入试管中，加入少量蒸馏水，用玻璃棒轻轻搅拌，使肾小管内容物充分溶解。
5. 葡萄糖注射：将家兔静脉注射葡萄糖溶液，注射剂量为1g/kg体重。
6. 尿液收集：收集家兔尿液，放入另一支试管中。
7. 糖定性实验：将尿液和肾小管内容物分别加入两支试管中，分别加入班氏试剂。
将试管放入加热器中加热煮沸，观察颜色变化。
五、实验结果1. 尿液：加热煮沸后，尿液变为砖红色，说明尿液中含有葡萄糖。
2. 肾小管内容物：加热煮沸后，肾小管内容物颜色无明显变化，说明肾小管对葡萄糖的重吸收功能正常。
六、实验分析1. 本实验结果表明，家兔肾脏具有对葡萄糖的重吸收功能。
临床免疫学检验的定性项目性能验证方案
临床免疫学检验的定性项目性能验证方案检验程序性能验证是临床实验室质量管理的关键技术要求，是保证实验室检测结果准确的前提。
根据中国合格评定国家认可委员会（CNAS）发布的《CNAS-GL038：临床免疫学定性检验程序性能验证指南》，要求申请认可或已获认可的医学实验室对临床免疫学（定性）检验程序，在新检验程序常规应用前、检验程序分析性能受影响后（如仪器主部件故障、仪器搬迁、环境失控等）、检验程序的任一要素（仪器、试剂、校准品等）变更等，都要对检验程序的性能进行验证或重新验证，通过验证结果来分析评估该检验程序是否符合实验室的质量管理要求并满足临床的诊断需要。
性能验证指标的选择应满足该项目检测的预期用途，临床免疫学定性检验程序的分析性能参数一般包括：符合率、精密度（重复性）、检出限、临界值、抗干扰能力、血清与血浆结果一致性等。
下面将对临床免疫学定性检验程序的符合率、精密度（重复性）、检出限和临界值这4个性能指标的验证方案进行介绍解释。
1符合率验证符合率验证的目的是评估该检验程序所检测结果的正确度，有两种验证方案，一是诊断符合率，采用国家标准血清盘或临床明确诊断的阴阳性样品进行比对；二是方法符合率，即与其他分析方法进行比对，包括用候选方法评估已知能力验证或室间质评的样本以及不同方法学或/和相同方法学在不同实验室之间的比对。
1.1诊断符合率验证选取国家标准血清盘或临床明确诊断的阴性样本20份（包含至少10份其他标志物阳性的样本）、阳性样本20份（包含至少10份浓度在cut-off值和2-4倍cut-off值之间的弱阳性样本，1份极高值阳性样本），随机分组分批检测样本，以国家标准血清盘或临床明确诊断的样本结果为金标准，计算候选检验程序所检测结果的诊断符合率，如表1，表1诊断符合率验证金标准合计+-候选检验程序+a b a+b -c d c+d合计n1n2n 诊断符合率计算：诊断灵敏度=[a/n1]×100%诊断特异性=[d/n2]×100%诊断符合率=[（a+d）/n]×100%验证通过标准：要求计算得出的诊断灵敏度、诊断特异性和诊断符合率不低于厂商检验方法声明。
定性免疫学检验的性能验证与质量控制
ISO15189实验室认可系列培训讲座
结果判断-4
用该方法检测，C50-20%的样本检测结果一致，C50+20%的样本不一定能得到一致 结果；需要用高于C50更大百分率浓度的样本（如+30%）进行补充试验。
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检出限的验证
n检测限（limit of detection）是指检测方法可检 测 出 的 最 低 被 测 量 浓 度 ， 也 称 检 测 低 限 （ lower limit of detection ） 或 最 小 检 出 浓 度 （ minimum detectable concentration），有时也称为分析灵敏 度（analytical sensitivity）。 n如前所述，分析物浓度位于C5-C95区间之外（小于 C5或大于C95）时，候选方法对同一样本的重复性检 测将得到相同结果。因此，C95代表了某一试剂可以 测出的最低被测量浓度。
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筛查试验
n筛查试验用于检测整个人群或部分人群中分析物的 存在情况。
n一般而言，筛查试验应当具有较高的临床敏感性（ 即临床检出率大于95%），对其特异性的要求（和阳 性预测值）则取决于对各种因素的综合考虑。
如粪便隐血检测
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n这里的C50指的是一个处于试剂检测临界点的样本浓 度，其一旦确定，是不变的。 n试剂盒CUT-OFF值指的是一个判断某一次测定结果的 由阴性和阳性对照信号值按一定公式计算出来的信号 值，每次测定都会有所差异。
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C5 浓度的定义
n一份样本，在多次重复实验中有95%的几率获得阴性 结果时该分析物的浓度。
检验方法性能验证
阳性结果的可靠性（预示值）：即测定为阳性的标 本实际上为阳性的可能性。 =[真阳性/（真阳性+假阳性）]×100%
阴性结果的可靠性（预示值）： 则为一份给出阴 性结果的样本实际上为阴性的可靠性。 = [真阴性/（真阴性+假阴性）]×100%
（一）准确度验证: 1 .样本的临床诊断已知（敏感性、特异性）
学比对） 3、可报告范围（验证最大稀释倍数） 4、参考区间（检测20个正常样本验证）
定量检测系统的性能评价
一 精密度评价 二 正确度评价 三 线性范围和可报告范围的评价
一、测定系统的关键要素
方法学
试剂配方 和来源
操作程序
测定系统
仪器
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校准品
二、评价的基本步骤 1. 确定方法的质量目标，总允许误差 2. 选定评价指标 有量值溯源的配套检测系统，正确度、精 密度、可报告评价的实验数据 4. 判断方法的临床可接收性
（二）正确度评价试验
1.用有量值溯源的参考物质进行测定 2.使用决定性方法或参考方法 3.与具有量值溯源检测系统进行比对
（1）EP方案（EP9-Ａ，EP15－A） （2）简易比对方案
(1) EP15－A方案
标本要求
应来源于健康人或患者，无明 显干扰因素。
全部标本在整个线性范围内均 匀分布，标本至少20例。
熟悉
三、评价文件（1）
EP5-A：临床化学设备操作精密度评价 核准指南 EP6-A：定量分析方法的线性评价： EP7-P：临床化学实验干扰 ，用于干扰物对检测结果
影响的定性。 EP9-A：用病人标本进行方法学比较和偏倚评估 ，主
要用于检测两种临床方法或设备间的偏倚。
评价文件（2）
EP10-A：定量实验室方法的初步评价 EP14-A：基质效应的评价 EP15-A：精密度和准确度性能的应用 EP21-P（NEW）：临床实验方法总分析误差的评估
脲酶定性实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的催化特性，掌握脲酶催化反应的原理；2. 掌握脲酶定性实验的操作方法；3. 通过实验观察脲酶催化反应的现象，验证脲酶的催化活性。
二、实验原理脲酶是一种催化脲水解的酶，其催化反应的化学方程式为：脲+ H2O → CO2 + NH3在本实验中，我们利用脲酶催化脲水解产生CO2和NH3的特性，通过观察溶液pH 的变化来验证脲酶的催化活性。
当脲酶催化脲水解时，生成的NH3会与溶液中的酸反应，使溶液pH值升高，当溶液pH值达到一定范围时，指示剂会发生颜色变化，从而验证脲酶的催化活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）脲酶试剂；（2）脲标准溶液；（3）NaOH标准溶液；（4）酚酞指示剂；（5）pH计；（6）锥形瓶；（7）移液管；（8）烧杯。
2. 实验仪器：（1）分析天平；（2）滴定管；（3）水浴锅；（4）磁力搅拌器。
四、实验步骤1. 配制脲酶溶液：将脲酶试剂溶解于适量的去离子水中，配制成一定浓度的脲酶溶液。
2. 配制脲标准溶液：准确称取一定量的脲，溶解于去离子水中，配制成一定浓度的脲标准溶液。
3. pH计校准：将pH计置于水浴锅中，加入去离子水，用pH计测量水的pH值，根据测量结果校准pH计。
4. 取锥形瓶，加入一定量的脲标准溶液。
5. 用移液管加入一定量的脲酶溶液，使脲酶与脲反应。
6. 将锥形瓶放入水浴锅中，保持一定的温度，使反应进行。
7. 在反应过程中，用pH计测量溶液的pH值，观察pH值的变化。
8. 当溶液pH值达到一定范围时，加入酚酞指示剂，观察溶液颜色变化。
9. 记录实验数据，包括脲酶溶液浓度、脲标准溶液浓度、反应时间、溶液pH值等。
五、实验结果与分析1. 实验现象：在脲酶催化下，脲水解产生CO2和NH3，使溶液pH值升高，当溶液pH值达到一定范围时，加入酚酞指示剂，溶液颜色由无色变为粉红色。
2. 结果分析：通过实验观察到，脲酶催化脲水解反应具有明显的催化活性，能够使溶液pH值发生变化，且加入酚酞指示剂后溶液颜色发生变化，进一步验证了脲酶的催化活性。
定性免疫学检验的性能验证与质量控制
检出限的验证方法
样本选择：评估试剂分析灵敏度所使用的样本，如 检测项目有国家参考品，则可使用国家参考品或经国 家参考品标化的参考品进行检测，如没有国家参考品 ，则使用可以溯源或量化的样本，如国际标准物质， 或与国际标准物质溯源的样本。 验证方法：处于测定下限浓度（ C95 ）的样本，重 复检测20次，应至少有18次以上为阳性反应。
精密度评估的基本原则（2）
评估精密度时，应至少评估两个浓度水平样本的精 密度。 所选样本浓度应在测量范围内有医学意义，即至少 有一个浓度在医学决定水平左右，在定性测定，即为 接近临界水平的浓度。
批内精密度的评估
评估方法：三个不同浓度的样本，在一个测试批内 重复进行至少20次检测，计算所得S/CO值的均值和SD ，计算批内CV%。 质量控制：检验时应同时至少测一个质控品。 判断结论：应≤试剂说明书所标明的批内变异。 ELISA的批内变异CV%应≤10%。
（三）准确度验证
验证方法及指标： 以与临床诊断、金标准方法和标准血清盘的检 测比较来评价，常以敏感性（包括临床敏感性）/ 特异性（包括临床特异性）和阳性符合率/阴性符 合率来表示。
临床特异性和临床敏感性
临床敏感性：在患有明确临床疾病的患者中，其检 测结果呈阳性或者超过正常值范围的比率 （即出现 阳性结果和确定患者患病）。 临床特异性：在没有特定临床疾病的患者中，其检 测结果呈阴性或者在正常值范围内的比率。
（一）不精密度的验证
纯定性试验：采用浓度接近临界值的分析物作为检 测材料，不宜采用阴性低值或强阳性样本来评价定性 检测方法的不精密度。 量值化定性试验：以COI（cut-off Index）或S/CO 比值作为分析方法的精密度评价指标。
纯定性测定不精密度的评估方法
定性测定的性能验证
定义
确认试验：确认试验用于验证筛查试验或者诊 断试验结果。如果确诊试验证实了之前的检测 结果，临床医生即可作出诊断。确认试验通过 设计使其具有较高的特异性（有时甚至以牺牲 敏感性为代价）以及高阳性预测值。螺旋体抗 体荧光吸附（FTA-ABS）梅毒血清学试验就 是一种用于VDRL梅毒血清学试验等筛查试验 之后的确认试验。
批间重复性的验证
高、中、低三个浓度的样本，在10 天以上时间内单次（孔或管）重复 进行20批检测，计算所得S/CO值的 均值和SD，计算批间CV%。
判断结论：应≤试剂说明书所标明的 批间变异。 ELISA的批间变异CV% 应≤15%。
测定下限的验证
处于测定下限浓度（如临界点 浓度+20%）的样本，重复检测 20次，应至少有18次以上为阳 性反应。
100 50 50%
30%-70% 35%-65% 40%-60%
C30-C70
候选方法的-20%～+20%浓度范 围是否包含了C5-C95区间？
1 +20% -20%
阳性结果=<35/40(87.5%) -20% ～ +20% 浓 度 范 围 在 用该方法检测浓度超过C50+20%的
C5-C95区间之内
样本检测结果不一致
阴性结果=<35/40(87.5%)
2 +20% 阳性结果>=36/40(90%) -20% 阴性结果>=36/40(90%)
-20%～+20%浓度范围包含 用该方法检测，C50+20%的样本检
了C5-C95区间
测结果一致
3 +20% -20%
4 +20% -20%
阳性结果>=36/40(90%) 阴性结果=<35/40(87.5%)
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Method validation of the qualitative test
几个重要概念及计算公式的回顾:
1.诊断敏感性:将实际患病者正确诊断为阳性的百分率。 诊断敏感性
计算公式为：真阳性 （真阳性+假阴性 假阴性） 计算公式为：真阳性/（真阳性 假阴性）X 100% . 2.特异性 : 指将实际无病者检测为阴性的百分率。 计算公式为：真阴性 真阴性+假阳性 假阳性） 计算公式为：真阴性/( 真阴性the qualitative test
精密度验证: 二.精密度验证 精密度验证
1.批内精密度:同一份样本在同一批次内平行重复检测 10次.然后计算均值,SD和CV. 2.批间精密度:同一份样本连续检测10天,每天平行检 测双孔.然后计算均值,SD和CV. Note:1.用S/CO比值进行统计计算. 2.最好选择临界值,或弱阳性样本.
Method validation of the qualitative test
验证的内容: 验证的内容 准确度(Accuracy) 准确度 精密度(Precision) 精密度 诊断敏感性（ 诊断敏感性（sensitivity of diagnosis） ） 特异性（specificity）: 特异性（ ）
比如麻疹病毒IgG,CP-IgG,MP-IgG等一系列病毒抗体IgG.因为很难确认体检者既 往是否有过感染史,而IgG抗体在体内存留时间长.因此很难收集到真正意义上的阴 性样本.
Method validation of the qualitative test
补充1:同一项目不同检测方法或仪器的比对 补充 同一项目不同检测方法或仪器的比对
适用范围:一个项目有两种以上的方法或者两台以上 适用范围 的仪器(包括同一型号的仪器)同时检测,需要进行一 致性比对. 定量检测中,报告单位不同的不需要比对
首次比对选取40份(20)样本,最好阴阳性各半
↓
随机每8份分成一组
↓
两种方法(或两台仪器)每天平行检测一组样本
↓
将所有检测结果汇总
↓
Kappa检验,评价一致性
方法B 阳性 方 法 A 阳性 阴性 合计 A C C1 阴性 B D C2 合计 R1 R2 N
Method validation of the qualitative test
准确度验证: 一.准确度验证 准确度验证
1 .检测已知值的参考物质 参考物质 • 室间质评材料 (卫生部或者CAP) • 厂商提供的已赋值的参考材料 • 分析用参考方法或决定方法定值的材料。(如 dsDNA检测) 2. 方法比较试验：样本数为10-20个，两种方法同 时测定同样的样品，用KAPPA检验方法分析两种 方法检测结果一致性.(比如HBV酶免法和发光法 比对)
Method validation of the qualitative test
补充说明:关于CUTOFF值验证 定量实验但是报告定性结果的才需要做 CUTOFF值验证.(比如PCR室的乙肝 DNA定性).
Method validation of the qualitative test
验证方法1: 找临界浓度的标准品(可要求厂家提供), 连续检测20次,95%的结果落在临界范围 即可. 验证方法2: 连续统计一段时间的检测结果,处于临界 范围的结果比例小于5%即可.
同一项目不同检测方法或仪器的比对 CUTOFF值验证
Method validation of the qualitative test
实施验证的时机: • 引进新检测项目及方法。 • 已确立的检测方法的更新。 • 原有的检测方法应用扩大到新的检测范 畴。 • 质控指标表明已确立的检测方法性能正 随时间而改变。
Method validation of the qualitative test
3.Kappa检验 检验: 检验 用与两组定性结果一致性比较.用公式 计算得到一个 kappa值. kappa值位 于〔-1,1〕, Kappa≥075时两组结果一 致性较好；0.75>Kappa≥0.4两者一致 性一般；Kappa<0.4表示两者一致性 很差. • 观察一致率P0 观察一致率P0 P0=（A+D）/ N • 机遇一致率Pc 机遇一致率Pc Pc=(R1C1/N + R2C2/N) / N • 实际观察一致率 P0 — Pc 实际观察一致率= • 非机遇一致率= 1- Pc 非机遇一致率 • Kappa= （ P0 — Pc）/（1- Pc）
Method validation of the qualitative test
特异性: 四.特异性 特异性
1.验证方法 验证方法：选取20份正常健康人血清（一般取自健康体检 者），计算其检测阴性结果所占百分率。 2.样本来源 样本来源:体检样本,体检者本人填写<健康调查表>确认符合 样本来源 要求后即可. NOTE:部分项目在健康体检人群中阳性率也很高,此类项目特 异性验证很难执行,建议引用厂家说明书.
判断标准:批内 小于 批间CV小于 判断标准 批内CV小于 批内 小于15%,批间 小于 批间 小于25%.
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诊断敏感性: 三.诊断敏感性 诊断敏感性
1.验证方法:取10-20份已知真阳性的样本（样本来源困难时 可以酌情减少）。用常规检测方法检测，计算检测阳性的 样本占样本总数的比例。 2.样本来源: 临床上明确诊断的阳性病人血清； 厂家提供的明确为阳性的样本； PT中的阳性样本； 决定性参考方法检测阳性的样本； 以上阳性样本来源紧张时，可以进行稀释（如2：3，3：4这 样稀释）
定性实验的方法学验证
Method validation of the qualitative test
李慧源 临床免疫学实验室 Kingmed clinical immunology Lab
Method validation of the qualitative test
验证目的: 1.评价和验证各定性检测项目的准确度、 精密度、灵敏度、特异性、等各项参数， 满足临床检测和认可组织的要求. 2.验证厂家提供的试剂参数能在本实验室 得到重现.
Method validation of the qualitative test
甲肝IgM定性项目方法学验证.doc 2008年3月优生仪器比对.doc 2008 3 .doc
Method validation of the qualitative test
参考资料:
1.《定性实验方法学验证管理程序》KM-MP0301.20 2. User Protocaln for Evaluation of Qualitative Test Performance Performance;Approved Guideline，NCCLS-EP12-A