毛孢子菌和镰刀菌的分类鉴定

第二部分 镰刀菌的分类鉴定
概 述
镰刀菌属（Fusarium spp. ）在自然界广泛存在， 与人类关系密切，有些种能引起农作物的病害导 致严重减产，有些种能产生植物激素，刺激农作 物生长 ◆镰刀菌是条件致病菌，临床上常可引起角膜炎、 甲真菌病等浅部感染，在免疫低下病人还可引起 系统性感染甚至死亡
多数水生，能在水中游动，腐生或 寄生，与医学关系不大
接合菌门 Zygomycota
虫霉目包括冠状耳霉和蛙粪霉 毛霉目包括根霉、毛霉、犁头霉、根毛霉
担子菌门 Basidiomycota
该门包括红酵母、隐球菌、掷孢酵母等
子囊菌门 Ascomycota
大部分真菌均属于此门，如曲霉、青霉、 链格孢、镰刀菌等
rDNA ITS序列测定：同源序列搜索的结果 与形态学鉴定结果一致 ◆RFLP分析：皮毛孢子菌的Cfr 13I RFLP带 型与阿 萨希毛孢子菌、皮瘤毛孢子菌的不 同；皮瘤毛孢子菌的NcoI RFLP带型与另 两者不一致
◆
12 11 10 9
8 7
6
5 4 3
2
1 M
12 11 10 9
8 7
6
5 4 3
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
实验结果
——生理学实验
◆
皮毛孢子菌的API 20C结果无法读取，其 它菌的API结果与形态学鉴定一致
实验结果
——温度实验
皮瘤毛孢子菌 皮毛孢子菌 阿萨希毛孢子菌 30℃ + + + 37℃ + + 42℃ -
实验结果
——分子生物学实验
2
1 M
Cfr13I酶切带型
NcoI酶切带型
M泳道为100bp ladder，1，3，5，7，9，11泳道依次为限制性 内切酶作用后的BMU00242，00706，01431，01463，02466， 00277的PCR扩增产物；2，4，6，8，10，12泳道依次为未经 限制性内切酶作用的BMU00242，00706，01431，01463， 02466，00277的PCR扩增产物
ITS1
ITS4 18S rDNA 5.8S rDNA 28S rDNA
真菌核糖体基因(rDNA)结构
第一部分 毛孢子菌的分类鉴定
概 述
毛孢子菌属（Trichosporon spp. ）属于担 子菌门无性型酵母菌，可引起皮肤感染、 肺部感染，阿萨希毛孢子菌甚至有播散性 感染的报道
实验目的
在形态学、营养生理学的基础上探讨 RFLP分析及rDNA ITS序列测定用于 区分不同的毛孢子菌种
◆
Trichosporon inkin（皮瘤毛孢子菌）
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
Trichosporon cutaneum（皮毛孢子菌）
菌落 SDA 22℃ 10天 MEA 22℃ 4天 （ × 400）
Trichosporon asahii（阿萨希毛孢子菌）
◆
◆
近年来，镰刀菌引起的感染有不断上升的趋 势，尤其在真菌性角膜炎中镰刀菌已占主导 地位 常规的镰刀菌鉴定方法费时、烦琐，往往不
能满足临床需要
◆
实验目的
对临床分离的镰刀菌进行分类鉴定，了解致病 菌种的分布情况 ◆从分子生物学角度寻找快速鉴定常见镰刀菌的 方法，为临床早期诊断提供依据
◆
材料与方法
实验菌株
编 号
BMU00242 BMU00277 BMU00706 BMU01431
种 名
Trichosporon inkin Trichosporon cutaneum Trichosporon asahii Trichosporon asahii
标本
血液 标准株 皮屑 肝组织
来 源
美国UTHSCSA ATCC-28592 北大一院 北京军区总院
◆
毛孢子菌属大部分种的ITS序列在Genbank中 均可查到，所以可通过测定rDNA ITS序列来 鉴定毛孢子菌 ◆Cfr 13I、Nco I 可区分皮瘤毛孢子菌、皮毛孢 子菌和阿萨希毛孢子菌，但由于实验菌种有限， 两者是否可用于鉴定毛孢子菌其他的种尚有待 进一步验证
◆
结论
1. 形态学是鉴定毛孢子菌的基础 2. API 20C 有其鉴定的局限性 3. 温度试验可区分皮毛孢子菌与 阿萨希毛孢子菌 4. 限制性内切酶Cfr13I、NcoI有望应用于皮瘤毛孢 子菌、皮毛孢子菌与 阿萨希毛孢子菌的鉴定 5. 通过rDNA ITS的序列测定可辅助鉴定毛孢子菌种
实验菌株：北大一院真菌中心保存的30株镰 刀菌、12株非镰刀菌，同仁医院眼科研究所 提供的68株镰刀菌，共110株 ◆实验方法： 形态学实验 分子生物学实验
◆
形态学实验
对同仁医院68株分离自病人角膜的镰刀菌进行 形态学鉴定 ◆大培养——将受试菌株种于PDA平板，25℃培 养，观察菌落形态、色泽 ◆小培养——将受试菌株种于钢圈内PDA， 25℃ 培养，观察大、小分生孢子的形态，瓶梗类型， 厚壁孢子的有无等
毛孢子菌和镰刀菌的 分类鉴定
真菌的分类
目前真菌界包括4个门： 壶菌门 Chytridiomycota 接合菌门 Zygomycota 担子菌门 Basidiomycota 子囊菌门 Ascomycota 半知菌 deuderomycetes （丝裂孢子真菌 Metoaporic fungi）
壶菌门 Chytridiomycota
BMU01463
BMU02466
Trichosporon asahii
Trichosporon asahii
标准株
痰
CBS.2479
北大一院
实验方法
形态学试验 ◆温度试验 ◆生理学试验
◆
rDNA ITS 测序 ◆ PCR-RFLP
◆
实验结果
——形态学
三种菌的菌落外观形态比较相似，呈白、黄 色、圆形，脑回状 ◆小培养镜下均可见到关节孢子，皮瘤毛孢子菌 还可见到鹿角菌丝，皮毛孢子菌及阿萨希毛孢 子菌可见到较多卵圆形的关节孢子
讨论
阿萨希毛孢子菌以前归属于皮毛孢子菌（皮毛 孢子菌又名白吉利毛孢子菌—T. beigelii），由 Sugita 1994年命名 ◆皮毛孢子菌API结果不理想，原因在于API 20C AUX （1997年）新版鉴定系统菌种库中没有T. cutaneum（皮毛孢子菌） ◆阿萨希毛孢子菌与皮毛孢子菌的形态及糖同化 实验相似，区别两者最简单的方法是温度试验