ACS Biomater. Sci. Eng.：将微结构化的电纺支架集成到开放的微流控系统中,以体外研究人源性原代细胞

ACS Biomater. Sci. Eng.：将微结构化的电纺支架集成到开放的微流控系统中，以体外研究人源性原代细胞
DOI: 10.1021/acsbiomaterials.0c00352
最近的研究表明，微环境刺激在调节细胞增殖和迁移以及调节具有干细胞（SCs）特性的乳腺细胞的自我更新和分化过程中起着重要作用。

目前，微/纳米技术和生物材料合成/工程方面的最新进展使构建适合于体外干细胞维持和分化的创新组织培养平台成为可能。

在此，研究者报告了一种开放式微流控设备（OMD）的设计和制造，该装置集成了可移除的聚己内酯（PCL）为基础的电纺支架，并且证明OMD可以实时研究体外培养过程中人类细胞的行为。

具有改良的表面形貌和化学性质的电纺支架可以影响乳腺干细胞的附着、增殖和分化，以及根据特制的纤维后处理所赋予的特定形态或生化线索来维持管腔细胞特性的表观遗传机制。

同时，OMD体系结构允许控制细胞的接种和培养条件，以收集更准确和有用的体外测定。

从长远角度来看，可以定制集成系统来模拟局部微环境的特定生理条件，然后分析筛选特定药物的反应，从而在个性化医学中进行更有效的诊断、长期预测和疾病干预。

图1.图A：PCL支架制备和表面改性方法的示意图。

在高压作用下，通过将带电的流体喷射沉积到金属面上来生成PCL纤维膜。

这些样本用作对照（类型S1）（上图）。

通过引入亲水性官能团（S2型），对PCL膜进行NaOH处理以改变表面化学性质（中心图）。

NaOH处理的PCL膜进一步用聚阳离子溶液处理，直到形成壳聚糖涂层（S3型）（下图）。

B图：组装好的设备的图片。

C图：用于将PCL膜集成或移除到微流控装置中的装置布局和程序。

将PCL支架放置在PDMS室中，然后用可移动的PDMS框架固定到位。

D图：单个腔室的剖面图。

微腔室的边缘充当多孔膜的支架，框架的插入可以将其可逆地固定在适当的位置，避免使用密封剂或粘合剂。

开放的腔室便于进入细胞。

图2.使用3D打印和复制成型方法制造PDMS微流控多层设备的过程。

A图：母版的制作。

图案的CAD设计（A1），使用立体光刻系统（A2）进行塑料母版的3D打印，以及母版的硅烷化（A3）。

B图：复制成型过程。

将10:1的PDMS 预聚物分配到母版（B1）上，进行交联（B2），然后将PDMS复制品与底片分开（B3）。

C图：组装多层装置。

将预聚物旋涂到盖玻片（C1）上，将器件层着墨到盖玻片（C2）上，在组装好的三层装置（C3）的烘箱中对齐并固化。

D 图：3D打印的母版和副本的图片。

培养室（母版I）、微室以及微通道的母版（母版II）（左）；从母版II（中央）上剥离副本；组装前母版I（顶层设备层）和II（中间设备层）的PDMS副本，以及三个PDMS框架，用于拉伸培养室和微室之间的不同支架（右）。

图3.PCL基电纺纤维。

经NaOH处理（S2）的电纺纤维和用作对照（S1）的未经处理的PCL纤维的AFM高度（A和C）和振幅图像（B和D）。

直方图显示了归一化的表面粗糙度、纤维的平均直径和附着力值。

测量单位：nm表示粗糙度，μm表示平均直径，mN表示附着力。

观察到表面粗糙度略有增加，并且纤维的平均直径减小。

PCL电纺纤维的形态分析：低（上）和高（下）放大SEM 图像（E）。

通过图像分析测量孔隙度（F）和孔径（G）。

数据表示为平均值±标准偏差（SD）。

标有（***）的样本表示两组之间存在统计学上的显著性差异（P***<0.001）。

图4.在不同的PCL支架条件S1、S2或S3下，培养的人类患者来源的MM细胞的相差（PC）和荧光图像。

用表达eGFP的慢病毒转导的具有SC特性的细胞产生MMs。

分散的MMs细胞在OMD中培养7天。

顶部和底部图片代表培养第3天（顶部）或第7天（底部）的细胞接种在未处理的（S1）、NaOH处理的（S2）和壳聚糖涂层的（S3）PCL支架上。

图5.在不同的PCL支架条件（S1，S2或S3）下培养的人类患者来源的MM细胞的单细胞活力分析。

图A：通过FACS获得的代表性点图：用藻红蛋白（PE）荧光通道检测到的活细胞DNA的碘化丙啶（PI）染色表明，在S1，S2和S3
条件下细胞活力相似。

每次FACS分析大约使用50,000个细胞。

X轴是PI染色与DNA结合的相对强度，以对数刻度显示。

Y轴是以线性比例显示的细胞侧向散射。

PI掺入的百分比越高表示由于凋亡、坏死或吞噬作用而导致细胞膜受损的细胞（图C）。

对照是未经PI染色（NS）的细胞。

B图：在经紫外光处理的NaOH-PCL（S2）上培养对照细胞以诱导细胞死亡。

C图：从每种PCL条件的3次重复实验的平均值获得的细胞活力分析的总结，垂直条为s.e.m的+/-。

活细胞是不经PI染色的细胞。

图D：PI细胞染色显示比例为5％，表明在所有PCL 培养条件下细胞生存力相似。

图6.在S1、S2或S3 PCL上培养的人类患者来源的MM细胞的细胞增殖分析。

图A：对于在S1、S2或S3上培养的细胞，细胞核的PI染色在细胞周期的所有
阶段均未显示出显著性差异。

染色体倍性2N、2N-4N和4N由PI结合DNA的相对强度确定。

FACS生成的直方图：纵轴是以线性刻度显示的相对细胞数，横轴是以对数刻度显示的PI结合到每个细胞DNA中的相对强度。

每次FACS分析大约使用50,000个细胞。

对于每种PCL培养条件，将实验重复3次。

B图：从每种PCL条件的3次重复实验的平均值获得的细胞周期分析的总结，垂直条为s.e.m.的+/-。

图7.在不同PCL支架条件（S1，S2或S3）下培养的人类患者来源的MM细胞中的Ki67蛋白免疫组织化学检测。

相位对比（PC）和DAPI荧光（蓝色）合并图像，Ki67荧光（绿色），Ki67和DAPI合并的荧光图像。

图8.在S1、S2或S3 PCL条件下培养的患者来源的MM细胞中，管腔标志物的qRT-PCR表达分析。

对以下获得的cDNA进行CK18和CDH1表达分析：来自患者产生的MMs细胞，所述MMs在悬浮条件下培养（MM）；从未经处理的（S1）、经NaOH处理的（S2）或壳聚糖涂层的（S3）PCL支架以及非恶性人类乳腺细胞系（MCF10A）采集的细胞。

表达相对于GAPDH(图A)或HPRT(图B)管家基因进行归一化，这些基因作为内源性对照，用于相对定量管腔标记物表达。

C图：HPRT1和GAPDH表达的平均值用作相对定量的内源对照。

数据表示为3次重复实验的平均值。

竖线表示置信区间CI => 95％。

相对于S2，显著性水平为
P**=<0.01和P***=<0.001。

结果来自3个独立实验。

图D：用3％琼脂糖凝胶电泳分析在qPCR扩增终点获得的RT-PCR产物。

来自以下物种的cDNA的HPRT1（103 bp）、GAPDH（75 bp）、CK18（104 bp）和CDH1（104 bp）的扩增子：乳腺球（MM），S1，S2，S3，MCF10A（MCF）以及无cDNA模板的PCR阴性对照（C）。

GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder（＃SM0321，Thermo Fisher）。

图9.图A：在S1、S2或S3 PCL培养条件下培养的患者来源的MM细胞中CDH1的免疫组织化学检测。

在PCL支架条件下（S1，S2或S3），DAPI（蓝色）染色细胞核中CDH1（红色）的免疫组织化学检测。

相位对比（PC）和DAPI荧光合并图像，DAPI荧光，CDH1荧光（红色）和DAPI合并图像。

B图：在S1、S2或S3 PCL培养条件下培养的患者来源的MM细胞中CK18的免疫组织化学检测。

PC和DAPI荧光（蓝色）合并的图像，DAPI荧光，CK18荧光（红色），CK18和DAPI合并图像。

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