微卫星DNAPCR扩增结果示例只是分享
微卫星实验的基本操作及常见问题
④为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶 剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。
⑤凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？
通常胶在30min-1h内凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS 剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化 成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太 硬易裂，电泳时易烧胶。 另外，还与环境温度有关，温度高则凝固时间短，反之，温度低则 凝固时间长。
微卫星实验的基本操作及 相关问题
一、实验小结
主要的基本操作依次如下： 1. 提取基因组DNA 2. 设计微卫星引物 3. PCR扩增 4. 琼脂糖凝胶的配制及电泳 5. PAGE检测 6. 数据分析处理
1. 提取基因组DNA
• 基本步骤 注意事项
1.抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切 力对DNA的损伤 2.离心后，不要晃动离心管，拿管要稳 3.加TE溶解前，DNA不能太干燥
5.PAGE检测
• 基本步骤：
①配胶 配制8%聚丙烯酰胺凝胶，具体配方是： 5*TBE 16ml 30%丙烯酰胺 21.28ml 10%APS 560ul TEMED 42ul 显影液配方 300mlddH2O,6gNaOH,0.12gNa2CO3，1.2ml甲醛（临显影 是再加） ②上样 样品是PCR扩增后的DNA ，上样缓冲液6xLoading Buffer，两者 1：1上样 ③电泳 120V，1-2h ④银染 染色过程为： 双蒸水冲洗两次→0.1%AgNO3银染10min→双蒸水漂洗2次，15s/次→ 显影液，显影10min→自来水冲洗至出现条带为止→成像系统照相保存
微卫星DNAPCR扩增结果示例
常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。
A CGT
位点1 位点2 位点3
芯片杂交结果示意图
基因变异的类型
1、点突变— １）单个碱基置换 ２）单个碱基的缺失或插入 2、片段缺失—编码片段；调节序列 3、片段插入—编码片段；调节序列 4、重排—融合基因 5、扩增—拷贝大量增加 6、动态突变—遗传物质传递过程中不等交 换使STR重复数增加
8kb
5kb
3kb
在个体和群体中，片段长度表现出多态性。 如3kb, 5kb, 7kb, 8kb… RFLP呈现孟德尔式遗传。 常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。
产生多态性的原因是内切酶位点的变化。 原位点的消失；新位点的产生。
GAATTC CTTAAG
GATTTC CTAAAG
I
12
II
1
2
7kb 5kb 3kb 2kb
2、第二代遗传标记—微卫星 DNA(Micro-satellite DNA)
属高度重复序列，重复单元2~6bp， 重复区大多几十~几百bp，分散在基因组 中，大多不存在于编码序列内，具有较高 的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫 星DNA已经发现了２万余个位点。
TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG
基因诊断
Gene Diagnosis
谭湘陵
南通医学院生物技术系遗传学教研室
基因诊断的概念— 直接在DNA或RNA水平上进行结构与功能检
测，从而辅助临床进行的诊断。
基因诊断是近年来临床医学中发展十分迅速的一 类崭新的诊断技术，它依托DNA重组技术，从基因 型入手，诊断表现型。（逆向诊断）
分子标记-RAPD和ISSR
二、基于PCR技术的分子标记 二、基于PCR技术的分子标记
随机扩增多态性DNA（ 随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、简单重复序列(Simple DNA，RAPD）、简单重复序列(Simple Sequence Repeat， ）、简单重复序列 Repeat， SSR) 、扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length 扩增片段长度多态性(Amplified Polymorphism， Polymorphism，AFLP )、ISSR（ inter-simple )、ISSR（ intersequence repeat ）
ISSR DNA-PCR扩增结果（示例）： 扩增结果（示例）： 扩增结果
ISSR引物 U807对两种铁皮石斛的扩增结果
ISSR引物 U826对两种铁皮石斛的扩增结果
分子标记类型
现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。 现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。 标记技术已有几十种 一、基于分子杂交的分子标记 这类标记利用限制性内切酶酶切及凝胶电泳分离不同 生物体的DNA分子 然后用特异探针进行杂交， 分子， 生物体的DNA分子，然后用特异探针进行杂交，通过放 射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性 的多态性。 射性自显影或非同位素显色技术揭示DNA的多态性。 （一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment 限制性片段长度多态性（ Length Polymorphism，RFLP） Polymorphism，RFLP） 小卫星DNA（ DNA） （二）小卫星DNA（Minisatellite DNA）
RAPD (random amplified polymorphic DNA） ）
应用微卫星标记分析一个日本锦鲤人工养殖群体的遗传多样性
应用微卫星标记分析一个日本锦鲤人工养殖群体的遗传多样性陈万光;崔智峰;董彬;王慧【摘要】采用12对微卫星引物,对一个日本锦鲤(Japanese koi)人工养殖群体的遗传多样性进行了检测.结果表明:该日本锦鲤群体在12个微卫星位点的平均等位基因数(Na)为4.916;群体的平均观测杂合度(Ho)为0.177 8;平均期望杂合度(He)为0.636 6;平均多态信息含量为0.554 9,表明其遗传多样性呈中等水平.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2008(000)005【总页数】3页(P48-50)【关键词】日本锦鲤;微卫星标记;遗传多样性【作者】陈万光;崔智峰;董彬;王慧【作者单位】洛阳师范学院生命科学系,河南洛阳,471022;山东农业大学动物科技学院,山东泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东泰安,271018;山东农业大学动物科技学院,山东泰安,271018【正文语种】中文【中图分类】S965.116日本锦鲤(Japanese koi)是一种体色鲜艳、斑纹华丽的变种鲤鱼。
目前世界上不同体色类型的日本锦鲤近百种，我国常见的品种有红白、大正三色、昭和三色、写鲤、浅黄、衣、丹顶、金银鳞、变种日本锦鲤等13个品系。
近年来日本锦鲤养殖技术日趋成熟，养殖者也逐年增多，其养殖逐渐成为发展农村经济新的增长点。
但经过连续多年人工繁殖后，日本锦鲤养殖群体由于近亲繁殖而导致其个体的生长速度和观赏价值等品质明显降低。
随着养殖规模的不断扩大，如何最大限度地保持养殖群体的遗传多样性，维持其优良品质，已成为人们关注的焦点。
微卫星作为一种分子遗传标记，拥有较高的个体特异性和可重复性[1]，并且能够提供丰富的多态位点及基因座位杂合度和纯合度等的遗传信息[2],因而被广泛应用于群体遗传多样性研究[3]、遗传作图[4]、亲子鉴定[5]、品种鉴定[6]和群体进化研究[7]等诸多领域。
目前，有关日本锦鲤遗传多样性的微卫星技术研究，国内开展的较少，刘静霞等[8]应用6对微卫星引物检测了20尾日本锦鲤个体，发现它们具有高度的遗传多态性，不同雌核发育家系内个体的遗传异质性也较大。
子午沙鼠DNA分子微卫星相关的引物筛选及评价生物科学专业论文设计
目录摘要 (1)Abstract (2)1文献综述 (3)1.1微卫星介绍 (3)1.2 微卫星位点筛选方法 (4)1.3子午沙鼠简介 (5)1.4 研究的目的和意义 (5)1.4.1 研究的目的 (6)1.4.2 研究意义 (6)2.材料与方法 (7)2.1 子午沙鼠基因组DNA的提取 (7)2.2 微卫星位点的选择与引物的合成 (7)2.3 PCR扩增，筛选位点 (8)2.4 筛选高多态性位点 (8)2.5微卫星分型 (9)3.实验结果 (10)3.1微卫星引物筛选结果 (10)3.2微卫星分型结果 (11)3.3微卫星位点遗传参数分析结果 (14)3.4累计排除率分析结果 (15)4.讨论 (17)5.结论 (19)参考文献 (20)致谢 (22)子午沙鼠DNA分子微卫星相关的引物筛选及评价摘要：分子微卫星是一种简单的，重复DNA序列，是真核生物基因组的重要成分之一，其种类多、分布广泛且具有高度的多态性和杂合度等特征。
作为高度可区分性的双亲遗传共显性标记，分子微卫星在亲权鉴定、系谱分析和物种遗传多样性分析中得到了广泛的应用。
因此，为了筛选子午沙鼠高多态性的微卫星位点，本研究选择20个长爪沙鼠(子午沙鼠近缘种)的微卫星位点，使用交叉扩增的方法进行筛选。
通过琼脂糖电泳筛选及微卫星分型验证，最终筛选出7个能够稳定扩增且同时具有高多态性的微卫星位点。
经验证，这七个位点在10个子午沙鼠个体中共扩增出127个等位基因，平均多态信息含量为0.822，平均期望杂合度为0.8849，均为高度多态位点。
因此，可以用于子午沙鼠遗传多样分析及遗传性婚配制度研究。
关键词：子午沙鼠；微卫星DNA；遗传多态性；微卫星分型Screening and evaluation of primers related to microsatellitein Midday gerbilsAbstract: Molecular microsatellite is a simple and repetitive DNA sequence, which is one of the important components of eukaryotic genome. It has many kinds, wide distribution and high polymorphism and heterozygosity. As a highly distinguishable parental codominant marker, microsatellite has been widely used in parental identification, pedigree analysis and species genetic diversity analysis. Therefore, in order to screen the microsatellite Loci with high polymorphism in Midday Jird, we selected 20 microsatellite Loci from close relatives of Midday jird Gerbils by cross-amplification. By agarose Gel electrophoresis and microsatellite typing, 7 microsatellite loci with stable amplification and high polymorphism were selected. It has been proved that these seven loci can be used in the analysis of genetic diversity and the study of genetic mating system in Midday jird.Key words: Midday Jird; microsatellite DNA; Single-nucleotide polymorphism；Microsatellite typing1文献综述1.1微卫星介绍微卫星也常被称为简单的碱基重复分子序列,是以1-6个简单核苷酸碱基为重复序列单位子所组成的5-40个简单分子串联体的重复分子序列。
基因组学课件遗传图绘制
Mechanism of DNA cleavage by the restriction
enzyme BamHI
In a RFLP, alleles may differ in the presence or absence of a cleavage site in the DNA
+ 长毛耳男人 ：患者的耳廓上长有长而硬的毛。这种病在印 第安人中发现的较多，高加利索人，澳大利亚土人、日本 人、尼日利亚人中也有少数发现
体细胞杂交定位法
+ 体细胞杂交定位法(somatic cell hybridization) + 应用不同物种的细胞培养获 得 杂种细胞系
(hybrid cell line)，根据不同杂种细胞中保留 的极少数人的染色体与某些相关基因的对 应关系进行基因定位的方法
+ DNA标记
DNA标记
RFLP (Restriction fragment length polymorphisms, 限制性片段长度多态 性) 简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphisrns, SSLPs） 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）
（1）限制性片段长度多态性(RFLP)
+ RFLP是指不同个体基因 组内的核苷酸序列因某 种原因产生碱基突变后 ，改变了某种限制性内 切酶的剪切位点，形成 了长度不等的限制性片 段
+ 限制性片段在人类不同 个体间呈现的多态性现 象称为限制片段长度多
微卫星DNA多态性在十种近交系小鼠遗传监测中的应用研究_欧阳兆和 (1)
2004年4月第14卷 第2期中国比较医学杂志CHINESE J OURNAL OF COMPAR ATIVE MEDICINE April ,2004Vol .14 No .2研究报告微卫星DNA 多态性在十种近交系小鼠遗传监测中的应用研究欧阳兆和1,陈振文1,李瑞生1,战大伟1,王承利2(1.军事医学科学院实验动物中心,北京 100071;2.沈阳军区总医院实验动物中心) 【摘要】 目的 研究微卫星DNA 多态性在近交系小鼠遗传监测中的应用。
方法 选取小鼠不同染色体上的16个微卫星位点,应用PCR 技术对常用的10个近交系小鼠进行了微卫星DNA 多态性分析。
结果 14个微卫星DNA 具有稳定扩增效果,在同一品系不同个体之间表现单态性;在不同品系之间表现多态性。
结论 运用所筛选的14个位点进行微卫星多态性分析,能够快速、经济地对近交系小鼠进行遗传监测。
【关键词】 遗传监测;小鼠,近交系;微卫星DNA【中图分类号】Q311+.8 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2004)02-0071-04Analysis of Microsatellite DNA Polymorphisms andGenetic Monitoring of Ten In bred Mouse StrainsOUYANG Zhao -he 1,C HE N Zhen -wen 1,LI Rui -sheng 1,ZHAN Da -wei 1,WANG Chen g -li 2(boratory Ani mal Center ,Academy of Military M edical Sciences ,Beijing 100071,China ;boratory Animal Center ,General Hospital of Shenyang Command of PLA )【Abstract 】 Objective To analyse microsatellite DNA polymorphisms and genetic monitoring of ten inbred mouse strains .Metheds 16microsatellites DNA loci on different chromosomes in ten inbred mouse strains were investigated by PCR analysis .Results Fourteen microsatellites DNA could be amplified efficiently ,and displayed polymorphis m among the various strains ,and no pol ymorphism in the same mouse strains .Conclusion Analysis of microsatellites DNA polymorphisms by the fourteen microsa -tellites DNA is a fast and economical way for genetic monitoring among ten in bred mouse strains .【Key words 】 Genetic monitoring ;Mice ,Inbred strains ;Microsatellite DNA[基金项目]总后卫生部基金课题资助(98M 116)[作者简介]欧阳兆和(1972-),男,硕士研究生,专业方向:实验动物遗传监测。
微卫星DNA
微卫星DNA微卫星DNA在种下分化及近缘种的鉴定中的应用农业昆虫与害虫防治姚远M071105摘要：微卫星DNA标记作为一种多态性和稳定性高、重复性好、呈共显性的分子遗传标记技术，目前已被广泛应用于昆虫学的研究中。
本文介绍了微卫星DNA标记的基本原理和特点，并综述了近年来该技术在昆虫种群遗传结构及分化、近缘种的鉴定、遗传图谱的构建、基因定位以及系统发生等领域中的应用。
关键词: 微卫星DNA标记；多态性；分化；种群早在1974 年，Skinger在蟹的DNA 中发现了一类短串联重复序列TAGG。
随后人们在人、动物和酵母的基因组中都发现了大量的简单重复序列，因为其比小卫星(10~25bp)短，每个重复单位仅1~6bp，重复数10~20次，是头尾相连的串联重复序列，故称微卫星(microsatellite)，又称为简单序列重复DNA(Simple Sequence Repeat，SSR)。
重复类型有两种单核苷酸如A/T、C/G；四种二核苷酸重复AT/TA、AC/TG、AG/TC、CG/GC 以及三、四核苷酸重复类型等，但研究发现较多的为AC/TG，约占57%，其它类型较少。
而且根据微卫星核心序列排列方式的不同，可分为完全(perfect)，不完全(imperfect)和复合型(compound)微卫星。
20世纪七八十年代以来，伴随着分子生物学的飞速发展，出现了多种多样的DNA分子标记[1]。
目前常用的DNA分子标记技术有限制性片段长度多态性( restriction fragment length polymorphism，RFLP) 、数量可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR) 、随机扩增多态性DNA ( random amp lified polymorphic DNA，RAPD) 、扩增片段长度多态性( amp lified fragment length polymorphism，AFLP) 、微卫星标记(microsatellite marker) 、简单重复序列间扩增( inter-simple sequence repeat，ISSR)和单核苷酸多态性( single nucleotide polymorphysm，SNP) 。
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DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。
循环数 ０
１
２
３
４
５
６
７
总片段（单链） ２
４
８
16
32
64
128
256
长片段（单链） 2
4
6
8
10
12
14
16
短片段（单链） 0
02Leabharlann 82252
114
240
预变性(92-95C,2-5m)
PCR的一般过程：
NTMC
Genetics
A CGT
位点1 位点2 位点3
芯片杂交结果示意图
NTMC
Genetics
基因变异的类型
1、点突变— １）单个碱基置换 ２）单个碱基的缺失或插入 2、片段缺失—编码片段；调节序列 3、片段插入—编码片段；调节序列 4、重排—融合基因 5、扩增—拷贝大量增加 6、动态突变—遗传物质传递过程中不等交 换使STR重复数增加
微卫星DNA差异最小只相差2个碱基（重 复片段只有2个碱基）。
NTMC
Genetics
2、第三代遗传标记—单核苷酸多态性 (SNP)
某些DNA位点上，单个碱基存在着变化 。如：
AATGGCGTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCAGCT 个体A
AATGGCCTAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCTGCT 个体B
遗传标记
1、第一代遗传标记—限制性酶切片段长度 多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)
8kb
5kb
3kb
在个体和群体中，片段长度表现出多态性。 如3kb, 5kb, 7kb, 8kb… RFLP呈现孟德尔式遗传。 常用检查方法：核酸杂交；PCR-酶切等。
AATGGCATAAGTCCGACCGTTCAGACTTGCCGGCT 个体C
SNP分布于整个基因组，可在基因内， 也可在基因间。估计每1000个bp存在一个。 在人类DNA序列变异中，SNP占90%。
单个碱基的插入和缺失不认为是SNP。 目前已知基因组中含有150万个SNP
NTMC
Genetics
NTMC
Genetic微s 卫星DNAPCR扩增结果示例
NTMC
Genetics
由于基因诊断的发展时间还不长，人类 对基因的了解还有许多空白，因此许多疾 病的诊断还主要依赖于传统的方法，但随 着分子遗传学、分子生物学，特别是人类 基因组计划的完成，基因诊断将显示出强 大的生命力。
NTMC
Genetics
NTMC
Genetics
基因诊断的技术方法
Southern 杂交
Northern 杂交
NTMC
Genetics
NTMC
Genetics
Western印迹 中蛋白电泳
PCR原理
NTMC
Genetics
PCR原理 １变性
NTMC
Genetics
PCR原理 １复性
NTMC
Genetics
PCR原理 １延伸
对于人类来说，SNP的意义在于： １、致病SNP ２、疾病易感性SNP ３、具有诊断价值的SNP ４、疾病的SNP谱 ５、人表型相关SNP ６、药物作用与不良反应的SNP ７、药物剂量SNP
目前SNP研究的两个热点： １、cDNA上的SNP（cSNP） ２、启动子上的SNP
常用检查方法：DNA测序、芯片杂交等。
NTMC
Genetics
PCR原理 ２变性
NTMC
Genetics
PCR原理 ２复性
NTMC
Genetics
PCR原理 ２延伸
NTMC
Genetics
PCR原理 ３变性
NTMC
Genetics
PCR原理 ３复性
NTMC
Genetics
PCR原理 ３延伸
NTMC
Genetics
NTMC
Genetics
当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以 合成等位基因特异的寡核苷酸探针（allelespecific oligonucleotide，ASO）用同位素或非 同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的 核苷酸。用于探测点突变时需要合成两种或两种 以上的探针，一种与正常基因序列完全一致，能 与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交； 另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列 稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这 样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区 别开来.
这些诊断有一个无法逾越的鸿沟：预测
也就是说“发病”了才能诊断。
基因诊断的对象
NTMC
Genetics
1、病原生物的侵入，如流感、肝炎、 艾滋病
2、单基因遗传性疾病， 如苯丙酮尿 症、无丙种球蛋白血症
3、多基因疾病，如肿瘤、高血压 4、其它，如亲子鉴定、个体识别、法 医物证
NTMC
Genetics
TTCAGCTAGCTCAGCAGCAGCAGCAGCAGAGCTTGC AAGTCGATCGAGTCGTCGTCGTCGTCGTCTCGAACG
常用检查方法：PCR等。
微卫星DNA PCR扩增结果（示例）：
NTMC
Genetics
500bp 400bp 300bp 240bp
该结果显示在所检查的人群中，该位点多 态性有4种。
NTMC
Genetics
产生多态性的原因是内切酶位点的变化。 原位点的消失；新位点的产生。
GAATTC CTTAAG
GATTTC CTAAAG
I
12
II
1
2
7kb 5kb 3kb 2kb
NTMC
Genetics
2、第二代遗传标记—微卫星 DNA(Micro-satellite DNA)
属高度重复序列，重复单元2~6bp， 重复区大多几十~几百bp，分散在基因组 中，大多不存在于编码序列内，具有较高 的多态性。呈现孟德尔式遗传。目前微卫 星DNA已经发现了２万余个位点。
传统的诊断（举例）：
１、问、望、听、触经验型诊断 ２、化验/检验—材料：细胞、组织、大分子、小分 子、代谢/排泄物等。方法：细胞学、微生物学、生 物化学、免疫学、病理学等。 ３、影像学—X光、B超、CT、核磁共振、内窥镜等 。 ４、特殊检查—染色体检查、肌电/心电/脑电、骨 密度等。
在医学发展的过程中，这些方法发挥了巨大作 用，随着技术水平的发展，这些方法也在不断提高 和完善，也还会有其他新的诊断方法的问世。
变性(92-95C,30s)
(25-35)
复性
(40-60C,30s)
延伸
(72C,30-60s)
总延伸
(72C,7m)
经过30次的循环, 扩增的DNA片段可达100万倍以上。
NTMC
Genetics
等位基因特异性寡核苷酸杂交（allelespecific oligonucleotide，ASO ）